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生物化学

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Published: March 14, 2021
doi:
10.3791/62177
, , ,
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

Summary

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸 をインビトロで輸送するかを決定するプロトコルについて説明する。

Abstract

進化的に保存されたオキシステロール結合タンパク質(OSBP)関連タンパク質(ORP)/OSBPホモログ(Osh)ファミリーのいくつかのメンバーは、最近、酵母およびヒト細胞における新しい脂質移動タンパク質(LTP)群を表していることが判明した。ホスファチジルセリン(PS)をPS/ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI)交換サイクル を介して 、小胞子(ER)から形質膜(PM)に移します。この知見により、シグナル伝達プロセスに重要なPSがどのように細胞全体に分布しているか、およびこのプロセスとホスホイノシチド(PIP)代謝との間のリンクの調査がより深く理解できる。新しい蛍光ベースのプロトコルの開発は、この新しい細胞機構の発見と特徴付け に 役立っています。本論文では、タンパク質がPSまたはPI(4)Pを抽出し、人工膜間で脂質を移動させる能力を測定するための、蛍光標識された2つの脂質センサNBD-C2ラクト およびNBD-PHFAPPの製造と使用について説明する。まず、プロトコルは、これら2つの構成体の高純度サンプルを製造、ラベル付け、取得する方法を記述する。第2に、これらのセンサーを蛍光マイクロプレートリーダーと併用して、タンパク質がPsまたはPI(4)Pをリポソームから抽出できるかどうかを判断する方法を、Osh6pをケーススタディとして使用する方法を説明する。最後に、このプロトコルは、定義された脂質組成のリポソーム間のPS/PI(4)P交換の運動量を正確に測定し、標準蛍光計を用いた蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)による脂質移動率を測定する方法を示す。

Introduction

異なる膜間および真核細胞1,2の膜内での脂質の正確な分布は、深い生物学的意味を有する。LTPsの機能の解読は、細胞生物学3、4、5、6、およびinvitroアプローチにおいて重要な問題であり、この問題7、8、9、10、11に対処する上で大きな価値がある。ここでは、細胞膜12間の複数のORP/Oshタンパク質がPS/PI(4)Pに影響を及ぼし、それによって新しいクラスのLTPsを構成することを確立するのに役立ったinvitro、蛍光ベースの戦略が提示される。 ERとPMの間の勾配に沿って分布し、グリセロリン脂質の5〜7%および最大30%をそれぞれ17、18、19に示す。また、PSは、PMの細胞体リーフレットに本質的に濃縮される。この蓄積とPMのPSの不均一なパーティションは、細胞信号プロセス19にとって重要です。PS分子の負電荷のために、PMの細胞体リーフレットは、他のオルガネラ1、2、19、20の細胞体リーフレットよりもはるかにアニオン性である。これにより、静電力を介して、ピリストアレートアラニンを豊富に含むCキナーゼ基質(MARCKS)21、肉腫(Src)22、キルステンラット肉腫ウイルス性腫瘍遺伝子(K-Ras)23、およびRas関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)24などのシグナル伝達タンパク質の採用を可能にする。

PSはまた、C2ドメイン25を介して立体選択的な方法で従来のプロテインキナーゼCによって認識される。ただし、PS は ER26で合成され、その役割を果たす前に PM にエクスポートする必要があることを示します。酵母では、Osh6pおよびOsh7pがERからPM27にPSを移すことを知るまで、これがどのように達成されたかは知られていませんでした。これらのLTPは、創設メンバーがOSBPであり、OSBP関連ドメイン(ORD)をポケットに組み込んで脂質分子をホストするタンパク質(ヒトのORP、酵母のオッシュタンパク質)を含む真核生物中の進化的に保存された家族に属しています。Osh6pとOsh7pは、構造特徴がPSを特異的に結合し、膜間で伝達するように適合したORDのみで構成されています。それにもかかわらず、これらのタンパク質がERからPMにPSをどのように方向的に移したかは不明であった。Osh6pとOsh7pは、PI(4)Pを代替脂質リガンド12としてトラップすることができます。酵母では、PI(4)Pはゴルジのホスファチジルイノシトール(PI)とPMからPI-4キナーゼ、Pik1pおよびStt4pによってそれぞれ合成される。対照的に、この脂質はSac1pホスファターゼによってPIに加水分解されるので、ER膜にはPI(4)Pはありません。したがって、PI(4)P 勾配は ER/ゴルギインターフェイスと ER/PM インターフェイスの両方に存在します。Osh6p および Osh7p は、これら 2 つの膜12の間に存在する PI(4)P 勾配を使用して、ER から PM に PS を転送します。

1サイクル内で、Osh6pはERからPSを抽出し、PMでPI(4)PにPSを交換し、PI(4)PをERに戻して別のPS分子を抽出します。Osh6p/Osh7pは、ER膜とPMを互いに近接して接続して近接させる数少ないタンパク質の1つであるIst2p28と相互作用し、酵母29、30、31にER-PMコンタクトサイトを作成する。また、負に帯電した膜とのOsh6pの関連は、その静電機能を変化させる立体構造変化によるタンパク質がその脂質リガンドの1つを抽出するとすぐに弱くなる32。これは、その膜のドウェル時間を短縮することによってOsh6pを助け、それによってその脂質移動活性の効率を維持する。Ist2pへの結合と組み合わせることで、このメカニズムにより、Osh6p/7pがER/PM界面で脂質交換を迅速かつ正確に実行することが可能になります。ヒト細胞では、ORP5およびORP8タンパク質は、ER-PM接触部位でPS/PI(4)P交換を個別のメカニズム33を介して実行する。それらは、Osh6pに似た中央ORDを有するが、C末端膜貫通セグメント33を介してERに直接固定され、PI(4)PおよびPI(4,5)P233、34、35を認識するN末端プレックストリン相同性(PH)ドメインを介してPMにドッキングする。ORP5/8はPI(4)Pを使用してPSを転送し、ORP5/8はさらにPM PI(4,5)P2レベルを調節し、シグナル伝達経路を調節することが示されています。PI(4)P および PI(4,5)P2レベルの低下は、これらのタンパク質が PIP 依存的な方法で PM に関連付けるため、ORP5/ORP8 活性を低下させます。レンツ・マジェフスキ症候群に至る異常に高いPS合成は、ORP5/836を通してPI(4)Pレベルに影響を与える。両方のタンパク質の活性が遮断されると、PSはPMであまり豊富になくなり、シグナル伝達タンパク質37の発癌能力を低下させる。

逆に、ORP5過剰発現は、癌細胞の浸潤と転移過程38を促進する。したがって、ORP5/8活性の変化は、脂質恒常性の変化を通じて細胞行動を著しく変化させることができる。また、ORP5およびORP8は、ER-ミトコンドリア接触部位を占有し、ミトコンドリア機能を保存し、PS39を供給する可能性がある。さらに、ORP5は、ER-脂質液滴接触部位に局地化し、PS/PI(4)P交換40によってPSを脂質滴に送達する。本明細書に記載されている戦略は、リポソームからの(i)PSおよびPI(4)P抽出物および(ii)リポソーム間のPSおよびPI(4)P輸送を測定し、Osh6p/Osh7p12、32のPS/PI(4)P交換活性を確立および分析するために考案され、他のグループがORP5/ORP835および他のLTPの活性を分析するために使用した 41.これは、それぞれPSとPI(4)Pを検出できる蛍光プレートリーダー、標準Lフォーマット分光蛍光計、および2つの蛍光センサ、NBD-C2ラクトとNBD-PHFAPPの使用に基づいています。

NBD-C2ラクトは、推定されるPS結合部位の近くにユニークな溶媒暴露システインを含むように再設計された糖タンパク質、ラクタドヘリンのC2ドメインに対応します。極性感受性のNBD(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾール)フルオロフォアは、この残基に共有結合している(図1A)12。より正確に言うと、ラクタドヘリンのC2ドメイン(ボストーラス、ユニプロート:Q95114、残留物270-427)を、大腸菌中のグルタチオンS-トランスバラーゼ(GST)と融合して発現させるpGEX-4T3ベクターにクローン化した。C2ラクト配列を突然変異させ、2つの溶媒にアクセス可能なシステイン残基(C270、 C427) アラニン残基を有し、その後N,N’-ジメチル-N-(イオダセチル)-N’-n-(7-ニトロベンツ-2-オキサ-1,3-ジアゾル-4-yl)エチレンジアミン(IANB)で標識することができる推定PS結合部位(H352C突然変異)近くの領域にシステイン残基を導入する血栓の切断部位は、C2ドメインのGSTタンパク質とN末語との間に存在する。主な利点は、このドメインが他の既知のC2ドメインまたはアネキシンA542に反してCa2+独立的な方法でPSを選択的に認識することです。NBD-PHFAPPは、ヒト4リン酸アダプタータンパク質1(FAPP1)のPHドメインに由来し、PI(4)P結合部位(図1A)の近傍にNBD基で標識することができる単一の溶媒暴露システインを含むように再設計された。ヒトFAPPタンパク質のPHドメインの塩基配列(UniProt:Q9HB20、セグメント[1-100])は、GSTタグと連換えて発現されるpGEX-4T3ベクターにクローン化されている。このPHFAPP配列は、タンパク質43の膜結合界面内に特有のシステイン残基を挿入するように改変されている。さらに、プロテアーゼへのアクセス性を確保するために、9残基リンカーが、PHドメインのトロンビン切断部位とN末語との間に導入された。

リポソームからのPS抽出を測定するには、 NBD-C2Lactは、微量のPSを含むホスファチジルコリン(PC)で作られたリポソームと混合され、PSに対する親和性のために、この構造はリポソームに結合し、NBDフルオロフォアは膜の疎水性環境に接触するにつれて極性の変化を経験する。PSが量論的量のLTPによってほぼ完全に抽出された場合、プローブはリポソームと関連せず、NBD信号は低い(図1B)32。この信号の違いは、LTP(例えば、Osh6p)がPSを抽出するかどうかを決定するために使用されます。同様の戦略は、前述の12, 32のように、NBD-PHFAPPと共に PI(4)P 抽出 (図 1B) を測定するために使用されます。2つのFRETベースのアッセイは、(i)それぞれER膜とPMを模倣するLAからLBリポソームへのPS輸送を測定し、(ii)逆方向にPI(4)P輸送を測定するように設計された。これらのアッセイは、PS/PI(4)P交換を測定するために同じ条件(すなわち、同じバッファー、温度、および脂質濃度)で行われます。PS輸送を測定するために、NBD-C2ラクトは、PCで構成されるLAリポソームと混合し、5モル%のPSおよび2モル%の蛍光ローダミン標識ホスファチジルエタノールアミン(Rhod-PE)およびLBリポソームを5モルPI%PI(4)Pを組み込んだ。

時間ゼロで、ロードPEを有するFRETは、NBD蛍光をクエンチする。PSがLAからLBリポソームに輸送される場合(例えば、Osh6pを注入すると)、LAからLBリポソームへのNBD-C2Lact分子の転位に伴い、速い脱健全性が生じる(図1C)。アクセス可能なPSの量を考えると、NBD-C2のラクトは、実験12の過程で本質的に膜結合状態のままである。したがって、NBDシグナルの強度は、LAとLBリポソーム間のNBD-C2ラクトの分布と直接相関し、PSが転送される量を決定するために容易に正規化することができる。PI(4)Pの逆方向の移動を測定するために、NBD-PHFAPPはLAおよびLBリポソームと混合される。PI(4)P を含むが、ロード-PEを含まない LBリポソームにのみ結合することを考えると、その蛍光は高い。PI(4)PがLAリポソームに移された場合、これらのリポソームに転写され、Rhod-PEを用いたFRETにより信号が減少する(図1C)。信号は正規化されて、PI(4)P が転送される量が43 になります。

Protocol

1. NBD-C2ラクトの精製 注:このプロトコルは、細菌を破壊する細胞破壊器の使用を詳述していますが、他のライシス戦略(例えばフランス のプレス)を使用するように変更することができます。精製の開始時に、システインの酸化を防ぐために、新たに脱気し、濾過し、2 mMジチオトライトール(DTT)を補充したバッファーを使用することが必須です。しかし、タン?…

Representative Results

図1: 蛍光脂質センサとインビトロアッセイの説明(A) ウシラクタジンのC2ドメインの結晶構造に基づくNBD-C2ラクトおよびNBD-PHFAPPの3次元モデル(PDB ID: 3BN648)およびヒトFAPP1タンパク質のPHドメインのNMR構造(PDB ID:2KJ46)<sup cl…

Discussion

これらのアッセイの結果は、蛍光脂質センサーのシグナルに直接依存します。したがって、これらのプローブの精製は、NBDと1:1の比率で、かつ無料のNBDフルオロフォア汚染なしに標識され、このプロトコルの重要なステップです。また、検査中のLTPが適切に折り畳まれ、集計されていないかどうかを確認することも必須です。抽出アッセイで試験したLTPの量は、このLTPがこれらの脂質を効率?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

原稿を慎重に校正してくれたA.カットトリス博士に感謝しています。この研究は、フランス国家研究庁の助成金ExCHANGE(ANR-16-CE13-0006)とCNRSによって資金提供されています。

Materials

 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare
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References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. 生物化学. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D’Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

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Ikhlef, S., Lipp, N., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).
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