Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

La distribuzione precisa dei lipidi tra le diverse membrane e all’interno delle membrane delle cellule eucariotiche^1,2 ha profonde implicazioni biologiche. Decifrare come funzionano le LTP è un problema importante nella biologia cellulare^3,4,5,6e gli approcci in vitro sono di grande valore nell’affrontare questo problema^7,8,9,10,11. Qui, viene presentata una strategia in vitro,basata sulla fluorescenza, che è stata determinante nello stabilire che diverse proteine ORP / Osh influenzano lo scambio PS / PI (4) P tra le membrane cellulari¹² e quindi costituiscono una nuova classe di LTP. PS è un glicerofosfolipide anionico che rappresenta il 2-10% dei lipidi totali di membrana nelle cellule eucariotiche^13,14,16. È distribuito lungo un gradiente tra l’ER e il PM, dove rappresenta il 5-7% e fino al 30% dei glicerofosfolipidi, rispettivamente^17,18,19. Inoltre, la PS è essenzialmente concentrata nel foglietto citosolico del PM. Questo accumulo e la partizione irregolare di PS nel PM sono fondamentali per i processi di segnalazione cellulare¹⁹. A causa della carica negativa delle molecole di PS, il foglietto citosolico del PM è molto più anionico del foglietto citosolico di altri organelli^1,2,19,20. Ciò consente il reclutamento, tramite forze elettrostatiche, di proteine di segnalazione come il substrato C-chinasi ricco di alanina miristoilata (MARCKS)²¹, sarcoma (Src)²², l’oncogene virale del sarcoma kirsten-ratto (K-Ras)²³e il substrato della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1)²⁴ che contengono un tratto di aminoacidi caricati positivamente e una coda lipidica.

Ps è anche riconosciuta dalla proteina chinasi C convenzionale in modo stereoselettivo tramite un dominio C2²⁵. Tuttavia, PS è sintetizzato in ER²⁶, indicando che deve essere esportato nel PM prima che possa svolgere il suo ruolo. Non si sapeva come ciò fosse stato realizzato¹⁹ fino alla scoperta che, nel lievito, Osh6p e Osh7p trasferiscono PS dal ER al PM²⁷. Questi LTP appartengono a una famiglia evolutivamente conservata negli eucarioti il cui membro fondatore è OSBP e che contiene proteine (ORP nell’uomo, proteine dell’Osh nel lievito) che integrano un dominio correlato all’OSBP (ORD) con una tasca per ospitare una molecola lipidica. Osh6p e Osh7p sono costituiti solo da un ORD le cui caratteristiche strutturali sono adattate per legare specificamente PS e trasferirlo tra le membrane. Tuttavia, non era chiaro come queste proteine trasferivano direzionalmente il PS dall’ER al PM. Osh6p e Osh7p possono intrappolare PI(4)P come ligando lipidico alternativo^12. Nel lievito, PI(4)P è sintetizzato dal fosfatidilinositolo (PI) nel Golgi e nel PM da PI 4-chinasi, Pik1p e Stt4p, rispettivamente. Al contrario, non c’è PI(4)P nella membrana ER, poiché questo lipide viene idrolizzato in PI dalla fosfatasi Sac1p. Quindi, un gradiente PI(4)P esiste in entrambe le interfacce ER/Golgi ed ER/PM. Osh6p e Osh7p trasferiscono PS dall’ER al PM tramite cicli di scambio PS/PI(4)P utilizzando il gradiente PI(4)P che esiste tra queste due membrane¹².

Entro un ciclo, Osh6p estrae PS dall’ER, scambia PS per PI(4)P al PM e trasferisce PI(4)P all’ER per estrarre un’altra molecola di PS. Osh6p/Osh7p interagiscono con Ist2p^28, una delle poche proteine che si connettono e portano la membrana ER e il PM in stretta vicinanza tra loro per creare siti di contatto ER-PM nel lievito^29,30,31. Inoltre, l’associazione di Osh6p con membrane caricate negativamente diventa debole non appena la proteina estrae uno dei suoi ligandi lipidici a causa di un cambiamento conformazionale che modifica le sue caratteristiche elettrostatiche³². Questo aiuta Osh6p accorciando il tempo di permanenza della membrana, mantenendo così l’efficienza della sua attività di trasferimento lipidico. Combinato con il legame a Ist2p, questo meccanismo potrebbe consentire a Osh6p / 7p di eseguire rapidamente e con precisione lo scambio lipidico all’interfaccia ER / PM. Nelle cellule umane, le proteine ORP5 e ORP8 eseguono lo scambio PS/PI(4)P nei siti di contatto ER-PM attraverso meccanismi distinti^33. Hanno un ORD centrale, simile a Osh6p, ma sono direttamente ancorati all’ER tramite un segmento transmembrana^{C-terminale 33} e si agganciano al PM tramite un dominio di omologia Pleckstrin (PH) N-terminale che riconosce PI(4)P e PI(4,5)P₂^33,34,35. ORP5/8 utilizza PI(4)P per trasferire PS, ed è stato dimostrato che ORP5/8 regola ulteriormente i livelli di PM PI(4,5)P₂ e presumibilmente modula le vie di segnalazione. A sua volta, una diminuzione dei livelli di PI(4)P e PI(4,5)P₂ abbassa l’attività di ORP5/ORP8 poiché queste proteine si associano al PM in modo dipendente dal PIP. La sintesi di PS anormalmente alta, che porta alla sindrome di Lenz-Majewski, influisce sui livelli di PI(4)P attraverso ORP5/8³⁶. Quando l’attività di entrambe le proteine è bloccata, ps diventa meno abbondante al PM, abbassando la capacità oncogenica di segnalare le proteine³⁷.

Al contrario, la sovraespressione di ORP5 sembra promuovere l’invasione delle cellule tumorali e i processi metastatici³⁸. Pertanto, le alterazioni dell’attività di ORP5/8 possono modificare gravemente il comportamento cellulare attraverso cambiamenti nell’omeostasi lipidica. Inoltre, ORP5 e ORP8 occupano siti di contatto ER-mitocondri e conservano alcune funzioni mitocondriali, possibilmente fornendo PS³⁹. Inoltre, ORP5 si localizza nei siti di contatto delle goccioline lipidiche ER per fornire PS alle goccioline lipidiche mediante scambio PS / PI (4) P⁴⁰. La strategia qui descritta per misurare (i) l’estrazione di PS e PI(4)P dai liposomi e (ii) il trasporto di PS e PI(4)P tra liposomi è stata ideata per stabilire e analizzare l’attività di scambio PS/PI(4)P di Osh6p/Osh7p^12,32 e utilizzata da altri gruppi per analizzare l’attività di ORP5/ORP8³⁵ e di altre LTP^{10, 41}. Si basa sull’uso di un lettore di piastre a fluorescenza, uno spettrofluorometro standard in formato L e due sensori fluorescenti, NBD-C2_Lact e NBD-PH_FAPP, in grado di rilevare rispettivamente PS e PI (4) P.

NBD-C2_Lact corrisponde al dominio C2 della glicoproteina, la lattaderina, che è stato riprogettato per includere un’unica cisteina esposta a solvente vicino al presunto sito di legame PS; un fluoroforo NBD sensibile alla polarità (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) è legato covalentemente a questo residuo (Figura 1A)¹². Per essere più precisi, il dominio C2 della lattaderina (Bos taurus, UniProt: Q95114,residui 270-427) è stato clonato in un vettore pGEX-4T3 da esprimere in fusione con la glutatione S-transferasi (GST) in Escherichia coli. La sequenza C2_Lact è stata quindi mutata per sostituire due residui di cisteina accessibili con solvente (C270, C427) con residui di alanina e per introdurre un residuo di cisteina in una regione vicino al presunto sito di legame con PS (mutazione H352C) che può essere successivamente etichettato con N,N’-dimetil-N-(iodoacetil)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) etilene diammina (IANBD) ¹². Un sito di scissione per la trombina è presente tra la proteina GST e l’N-terminus del dominio C2. Un grande vantaggio è che questo dominio riconosce selettivamente PS in modo indipendente da Ca²⁺contrariamente ad altri domini C2 noti o All’allegato A5⁴². NBD-PH_FAPP è derivato dal dominio PH della proteina umana 1 adattatrice di quattro fosfati (FAPP1), che è stata riprogettata per includere una singola cisteina esposta a solventi che può essere etichettata con un gruppo NBD vicino al sito di legame PI(4)P (Figura 1A)⁴³. La sequenza nucleotidica del dominio PH della proteina FAPP umana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) è stata clonata in un vettore pGEX-4T3 da esprimere in tandem con un tag GST. La sequenza PH_FAPP è stata modificata per inserire un unico residuo di cisteina all’interno dell’interfaccia di legame della membrana della proteina^43. Inoltre, è stato introdotto un linker a nove residui tra il sito di scissione della trombina e l’N-terminus del dominio PH per garantire l’accessibilità alla proteasi.

Per misurare l’estrazione di PS dai liposomi, NBD-C2_Lact viene miscelato con liposomi costituiti da fosfatidilcolina (PC) contenenti tracce di PS. A causa della sua affinità per PS, questo costrutto si lega ai liposomi e il fluoroforo NBD subisce un cambiamento di polarità quando entra in contatto con l’ambiente idrofobo della membrana, che provoca un blue-shift e un aumento della fluorescenza. Se ps viene estratto quasi completamente da una quantità stechiometrica di LTP, la sonda non si associa ai liposomi e il segnale NBD è inferiore (Figura 1B)³². Questa differenza di segnale viene utilizzata per determinare se un LTP(ad esempio, Osh6p) estrae PS. Una strategia simile viene utilizzata con NBD-PH_FAPP per misurare l’estrazione di PI(4)P (Figura 1B), come descritto in precedenza^12,32. Due saggi basati su FRET sono stati progettati per (i) misurare il trasporto di PS dai liposomi L_A a L_B, che imitano rispettivamente la membrana ER e il PM, e (ii) il trasporto PI(4)P nella direzione inversa. Questi test vengono eseguiti nelle stesse condizioni(cioè stesso tampone, temperatura e concentrazione lipidica) per misurare lo scambio PS/PI(4)P. Per misurare il trasporto di PS, NBD-C2_Lact viene miscelato con liposomi L_A composti da PC e drogati con il 5 mol% di PS e il 2 mol% di una fosfatidiletanolammina fluorescente marcata con rodamina (Rhod-PE) e liposomi L_B che incorporano il 5 mol% di PI(4)P.

Al tempo zero, FRET con Rhod-PE spegne la fluorescenza NBD. Se la PS viene trasportata dai liposomi L_A a L_B (ad esempio, dopo l’iniezione di Osh6p), si verifica un rapido dequenching a causa della traslocazione di molecole NBD-C2_Lact dai liposomi L_A a L_B (Figura 1C). Data la quantità di PS accessibile, NBD-C2_Lact rimane essenzialmente in uno stato legato alla membrana nel corso dell’esperimento¹². Pertanto, l’intensità del segnale NBD è direttamente correlata alla distribuzione di NBD-C2_Lact tra i liposomi L_A e L_B e può essere facilmente normalizzata per determinare la quantità di PS trasferita. Per misurare il trasferimento di PI(4)P nella direzione opposta, NBD-PH_FAPP viene miscelato con liposomi L_A e L_B; dato che si lega solo ai liposomi L_B che contengono PI(4)P, ma non Rhod-PE, la sua fluorescenza è elevata. Se PI(4)P viene trasferito ai liposomi L_A, si trasloca in questi liposomi e il segnale diminuisce a causa di FRET con Rhod-PE (Figura 1C). Il segnale viene normalizzato per determinare quanto PI(4)P viene trasferito⁴³.