JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Fluorescentie-gebaseerde metingen van fosfatidylserine / fosfatidylinositol 4-fosfaatuitwisseling tussen membranen

Published: March 14, 2021
doi:
10.3791/62177
, , ,
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

Summary

Hier beschrijven we protocollen met behulp van fluorescerende lipidesensoren en liposomen om te bepalen of een eiwit fosfatidylserine of fosfatidylinositol 4-fosfaat in vitroextraheert en transporteert .

Abstract

Verschillende leden van de evolutionair geconserveerde oxysterol-bindend eiwit (OSBP) -gerelateerde eiwitten (ORP) / OSBP-homologen (Osh) -familie zijn onlangs gevonden om een nieuwe lipide transfer eiwit (LTP) -groep in gist en menselijke cellen te vertegenwoordigen. Ze brengen fosfatidylserine (PS) over van het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het plasmamembraan (PM) via PS/fosfatidylinositol 4-fosfaat (PI(4)P) uitwisselingscycli. Deze bevinding maakt een beter begrip mogelijk van hoe PS, dat van cruciaal belang is voor signaleringsprocessen, door de cel wordt verdeeld en het onderzoek naar het verband tussen dit proces en het fosfoinositide (PIP) metabolisme. De ontwikkeling van nieuwe op fluorescentie gebaseerde protocollen heeft een belangrijke rol gespeeld bij de ontdekking en karakterisering van dit nieuwe cellulaire mechanisme in vitro op moleculair niveau. Dit artikel beschrijft de productie en het gebruik van twee fluorescerend gelabelde lipidesensoren, NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP, om het vermogen van een eiwit te meten om PS of PI(4)P te extraheren en deze lipiden over te brengen tussen kunstmatige membranen. Ten eerste beschrijft het protocol hoe u zeer zuivere monsters van deze twee constructies kunt produceren, labelen en verkrijgen. Ten tweede legt dit artikel uit hoe deze sensoren met een fluorescentiemicroplaatlezer kunnen worden gebruikt om te bepalen of een eiwit PS of PI(4)P uit liposomen kan extraheren, met behulp van Osh6p als casestudy. Ten slotte laat dit protocol zien hoe de kinetiek van PS/ PI(4)P-uitwisseling tussen liposomen met gedefinieerde lipidesamenstelling nauwkeurig kan worden gemeten en hoe lipideoverdrachtssnelheden kunnen worden bepaald door fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) met behulp van een standaard fluorometer.

Introduction

De precieze verdeling van lipiden tussen verschillende membranen en binnen de membranen van eukaryote cellen1,2 heeft diepgaande biologische implicaties. Het decoderen van hoe LTP’s functioneren is een belangrijke kwestie in de celbiologie3,4,5,6,en in vitro benaderingen zijn van grote waarde bij het aanpakken van dit probleem7,8,9,10,11. Hier wordt een op in vitro,fluorescentie gebaseerde strategie gepresenteerd die een belangrijke rol heeft gespeeld bij het vaststellen dat verschillende ORP / Osh-eiwitten PS / PI (4) P-uitwisseling tussen celmembranen12 beïnvloeden en daardoor een nieuwe klasse LTP’s vormen. PS is een anionisch glycerofosfolipide dat 2-10% van de totale membraanlipiden in eukaryote cellenvertegenwoordigt 13,14,16. Het wordt verdeeld langs een gradiënt tussen de ER en de PM, waar het 5-7% en tot 30% van de glycerofosfolipiden vertegenwoordigt, respectievelijk17,18,19. Bovendien is PS in wezen geconcentreerd in de cytosolische bijsluiter van de PM. Deze opbouw en de ongelijke verdeling van PS in de PM zijn van cruciaal belang voor cellulaire signaleringsprocessen19. Vanwege de negatieve lading van PS-moleculen is de cytosolische bijsluiter van de PM veel anionischer dan de cytosolische folder van andere organellen1,2,19,20. Dit maakt de rekrutering mogelijk, via elektrostatische krachten, van signaaleiwitten zoals myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS)21, sarcoom (Src)22, Kirsten-rat sarcoom viral oncogene (K-Ras)23en Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1)24 die een stuk positief geladen aminozuren en een lipide staart bevatten.

PS wordt ook herkend door conventioneel eiwitkinase C op een stereoselectieve manier via een C2-domein25. PS wordt echter gesynthetiseerd in de ER26, wat aangeeft dat het naar de PM moet worden geëxporteerd voordat het zijn rol kan spelen. Het was niet bekend hoe dit werd bereikt19 tot de bevinding dat, in gist, Osh6p en Osh7p PS overbrengen van de ER naar de PM27. Deze LTP’s behoren tot een evolutionair geconserveerde familie in eukaryoten waarvan het stichtende lid OSBP is en die eiwitten bevat (ORP’s in de mens, Osh-eiwitten in gist) die een OSBP-gerelateerd domein (ORD) integreren met een pocket om een lipidemolecuul te hosten. Osh6p en Osh7p bestaan alleen uit een ORD waarvan de structurele kenmerken zijn aangepast om PS specifiek te binden en over te brengen tussen membranen. Niettemin was onduidelijk hoe deze eiwitten PS van de ER naar de PM overdroegen. Osh6p en Osh7p kunnen PI(4)P vangen als alternatief lipideligand12. In gist wordt PI(4)P gesynthetiseerd uit fosfatidylinositol (PI) in de Golgi en de PM door respectievelijk PI 4-kinases, Pik1p en Stt4p. Daarentegen is er geen PI(4)P in het ER-membraan, omdat dit lipide door de Sac1p-fosfatase tot PI wordt gehydrolyseerd. Daarom bestaat er een PI(4)P-gradiënt op zowel de ER/Golgi- als de ER/PM-interfaces. Osh6p en Osh7p brengen PS over van de ER naar de PM via PS/PI(4)P-uitwisselingscycli met behulp van de PI(4)P-gradiënt die bestaat tussen deze twee membranen12.

Binnen één cyclus haalt Osh6p PS uit de ER, wisselt PS in voor PI(4)P bij de PM en brengt PI(4)P terug naar de ER om een ander PS-molecuul te extraheren. Osh6p / Osh7p interageren met Ist2p28, een van de weinige eiwitten die het ER-membraan en de PM in de nabijheid van elkaar brengen om ER-PM-contactsites in gist29,30, 31te creëren. Bovendien wordt de associatie van Osh6p met negatief geladen membranen zwak zodra het eiwit een van zijn lipideliganden extraheert als gevolg van een conformatieverandering die de elektrostatische kenmerken wijzigt32. Dit helpt Osh6p door de verblijftijd van het membraan te verkorten, waardoor de efficiëntie van zijn lipidenoverdrachtsactiviteit behouden blijft. In combinatie met de binding aan Ist2p zou dit mechanisme Osh6p/7p in staat kunnen stellen om zowel snel als nauwkeurig lipidenuitwisseling uit te voeren op de ER/PM-interface. In menselijke cellen voeren ORP5- en ORP8-eiwitten PS/PI(4)P-uitwisseling uit op ER-PM-contactplaatsen via verschillende mechanismen33. Ze hebben een centrale ORD, vergelijkbaar met Osh6p, maar zijn direct verankerd aan de ER via een C-terminal transmembraansegment33 en dokken in de PM via een N-terminal Pleckstrin homologie (PH) domein dat PI(4)P en PI(4,5)P233,34,35herkent. ORP5/8 gebruikt PI(4)P om PS over te dragen, en het is aangetoond dat ORP5/8 bovendien PM PI(4,5)P2-niveaus reguleert en vermoedelijk signaleringsroutes moduleert. Op zijn beurt verlaagt een afname van PI(4)P- en PI(4,5)P2-niveaus de ORP5/ORP8-activiteit omdat deze eiwitten zich op een PIP-afhankelijke manier associëren met de PM. Abnormaal hoge PS-synthese, die leidt tot het Lenz-Majewski-syndroom, beïnvloedt PI (4) P-niveaus via ORP5 / 836. Wanneer de activiteit van beide eiwitten wordt geblokkeerd, wordt PS minder overvloedig bij de PM, waardoor het oncogene vermogen van signaaleiwitten wordt verlaagd37.

Omgekeerd lijkt ORP5-overexpressie de invasie van kankercellen en gemetastaseerde processen te bevorderen38. Veranderingen in ORP5/8-activiteit kunnen dus het cellulaire gedrag ernstig veranderen door veranderingen in lipidehomeostase. Verder bezetten ORP5 en ORP8 ER-mitochondria contactplaatsen en behouden ze enkele mitochondriale functies, mogelijk door PS39te leveren . Bovendien lokaliseert ORP5 naar ER-lipidedruppelcontactplaatsen om PS aan lipidedruppels te leveren door PS / PI (4) P-uitwisseling40. De hierin beschreven strategie om (i) PS- en PI(4)P-extractie uit liposomen en (ii) PS- en PI(4)P-transport tussen liposomen te meten, is ontwikkeld om de PS/PI(4)P-uitwisselingsactiviteit van Osh6p/Osh7p12,32 vast te stellen en te analyseren en door andere groepen gebruikt om de activiteit van ORP5/ORP835 en andere LTP’s te analyseren10, 41. Het is gebaseerd op het gebruik van een fluorescentieplaatlezer, een standaard L-formaat spectrofluorometer en twee fluorescerende sensoren, NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP, die respectievelijk PS en PI (4) P kunnen detecteren.

NBD-C2Lact komt overeen met het C2-domein van het glycoproteïne, lactadherine, dat opnieuw werd ontworpen om een uniek aan oplosmiddel blootgesteld cysteïne in de buurt van de veronderstelde PS-bindingsplaats te omvatten; een polariteitsgevoelige NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluorofoor is covalent gekoppeld aan dit residu (figuur 1A)12. Om preciezer te zijn, werd het C2-domein van lactadherine (Bos taurus, UniProt: Q95114, residuen 270-427) gekloond tot een pGEX-4T3-vector om te worden uitgedrukt in fusie met glutathion S-transferase (GST) in Escherichia coli. De C2Lact-sequentie werd vervolgens gemuteerd om twee oplosmiddeltoegankelijke cysteïneresiduen (C270, C427) te vervangen door alanineresiduen en om een cysteïneresidu in te brengen in een gebied in de buurt van de vermeende PS-bindingsplaats (H352C-mutatie) dat vervolgens kan worden gelabeld met N,N’-dimethyl-N-(joodacetyl)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) ethyleendiamine (IANBD) 12. Een splitsingsplaats voor trombine is aanwezig tussen het GST-eiwit en de N-terminus van het C2-domein. Een groot voordeel is dat dit domein PS selectief herkent op een Ca2+-onafhankelijke manier in tegenstelling tot andere bekende C2-domeinen of Annexin A542. NBD-PHFAPP is afgeleid van het PH-domein van het menselijke vierfosfaat-adaptoreiwit 1 (FAPP1), dat opnieuw is ontworpen om een enkele aan oplosmiddelen blootgestelde cysteïne te bevatten die kan worden gelabeld met een NBD-groep in de buurt van de PI(4)P-bindingsplaats (Figuur 1A)43. De nucleotidesequentie van het PH-domein van het menselijke FAPP-eiwit (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) is gekloond tot een pGEX-4T3-vector die samen met een GST-tag tot expressie wordt gebracht. De PHFAPP-sequentie is aangepast om een uniek cysteïneresidu in te brengen in de membraanbindende interface van het eiwit43. Bovendien is een negenresidu-linker geïntroduceerd tussen de trombinesplitsingsplaats en de N-terminus van het PH-domein om de toegankelijkheid van het protease te waarborgen.

Om PS-extractie uit liposomen te meten, wordt NBD-C2Lact gemengd met liposomen gemaakt van fosfatidylcholine (PC) met sporenhoeveelheden PS. Vanwege de affiniteit voor PS bindt dit construct aan de liposomen en de NBD-fluorofoor ervaart een verandering in polariteit als het in contact komt met de hydrofobe omgeving van het membraan, wat een blauwverschuiving en een toename van fluorescentie opwekkendt. Als PS bijna volledig wordt geëxtraheerd door een stoichiometrische hoeveelheid LTP, associeert de sonde zich niet met liposomen en is het NBD-signaal lager (Figuur 1B)32. Dit verschil in signaal wordt gebruikt om te bepalen of een LTP(bijvoorbeeld Osh6p) PS extraheert. Een vergelijkbare strategie wordt gebruikt met NBD-PHFAPP om PI(4)P extractie te meten(Figuur 1B), zoals eerder beschreven12,32. Twee fret-gebaseerde assays werden ontworpen om (i) PS-transport van LA naar LB liposomen te meten, die respectievelijk het ER-membraan en de PM nabootsen, en (ii) PI(4)P-transport in de omgekeerde richting. Deze testen worden uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden(d.w.z. dezelfde buffer, temperatuur en lipidenconcentratie) om PS / PI (4) P-uitwisseling te meten. Om ps-transport te meten, wordt NBD-C2lact gemengd met LA liposomen samengesteld uit PC en gedopeerd met 5 mol% PS en 2 mol% van een fluorescerende rhodamine-gelabelde fosfatidylethanolamine (Rhod-PE) – en LB liposomen met 5 mol% PI (4) P.

Op tijdstip nul dooft FRET met Rhod-PE de NBD-fluorescentie. Als PS wordt getransporteerd van LA naar LB liposomen(bijvoorbeeld bij het injecteren van Osh6p), treedt een snelle dequenching op als gevolg van de translocatie van NBD-C2Lactmoleculen van LA naar LB liposomen(Figuur 1C). Gezien de hoeveelheid toegankelijke PS blijft NBD-C2Lact in wezen in een membraangebonden toestand in de loop van het experiment12. De intensiteit van het NBD-signaal correleert dus direct met de verdeling van NBD-C2Lact tussen LA- en L B-liposomen en kan gemakkelijk worden genormaliseerd om te bepalen hoeveel PS wordt overgedragen. Om de overdracht van PI(4)P in de tegenovergestelde richting te meten, wordt NBD-PHFAPP gemengd met LA- en L B-liposomen; aangezien het alleen bindt aan L B-liposomen die PI(4)P bevatten, maar niet aan Rhod-PE, is de fluorescentie hoog. Als PI(4)P wordt overgebracht naar LA liposomen, transloceert het naar deze liposomen en neemt het signaal af als gevolg van FRET met Rhod-PE(Figuur 1C). Het signaal wordt genormaliseerd om te bepalen hoeveel PI(4)P wordt overgedragen43.

Protocol

1. Zuivering van NBD-C2Lact OPMERKING: Hoewel dit protocol het gebruik van een celverstoorder beschrijft om bacteriën te breken, kan het worden gewijzigd om andere lysisstrategieën te gebruiken(bijvoorbeeld een Franse pers). Aan het begin van de zuivering is het verplicht om buffer te gebruiken die vers wordt ontgast, gefilterd en aangevuld met 2 mM dithiothreitol (DTT) om de oxidatie van cysteïne te voorkomen. Voor de stap voor eiwitetikettering is het echter cruciaal om …

Representative Results

Figuur 1: Beschrijving van de fluorescerende lipidesensoren en in vitro assays. (A) Driedimensionale modellen van NBD-C2Lact en NBD-PHFAPP op basis van de kristalstructuur van het C2-domein van runderlactadherine (PDB ID: 3BN648) en de NMR-structuur van het PH-domein van het menselijke FA…

Discussion

De uitkomsten van deze testen zijn direct afhankelijk van de signalen van de fluorescerende lipidesensoren. De zuivering van deze sondes met een verhouding van 1:1 met NBD en zonder vrije NBD-fluorofoorverontreiniging is dus een cruciale stap in dit protocol. Het is ook verplicht om te controleren of de onderzochte LTP goed is gevouwen en niet geaggregeerd. De hoeveelheid LTP die in de extractietests wordt getest, moet gelijk zijn aan of hoger zijn dan die van toegankelijke PS- of PI(4)P-moleculen om goed te kunnen meten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn Dr. A. Cuttriss dankbaar voor haar zorgvuldige proeflezing van het manuscript. Dit werk wordt gefinancierd door de Subsidie exCHANGE van het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-16-CE13-0006) en door het CNRS.

Materials

 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. 生物化学. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D’Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

FluorescencePhosphatidylserinePhosphatidylinositol 4-phosphateLipid TransferMembraneLiposomesNBD-C2 LactLipid SensorLipid Transfer ProteinNBD-PH FAPP ProbePI(4)P Extraction AssayHEPES Potassium Acetate BufferMagnesium ChloridePhosphatidylcholinePhosphatidylethanolamine

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ikhlef, S., Lipp, N., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image