Un ensayo basado en placas para la medición de la liberación endógena de monoamina en cortes cerebrales agudos

Una gran cantidad de enfermedades neurológicas y psiquiátricas se asocian con la desregulación o el mantenimiento insuficiente de la homeostasis del neurotransmisor monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norepinefrina [NE])^1,2,3. Estas afecciones incluyen, entre otras, ^{depresión1,2}, ^{esquizofrenia2}, ^ansiedad2, ^adicción4, menopausia5,6,7, ^dolor8 y enfermedad de ^Parkinson3. Por ejemplo, varios modelos de menopausia en ratas han demostrado que la desregulación o reducción de las monoaminas dentro del hipocampo, la corteza prefrontal y el cuerpo estriado puede estar asociada tanto con la depresión como con el deterioro cognitivo, que se observa en mujeres que experimentan la menopausia. La desregulación de las monoaminas en estos modelos ha sido ampliamente examinada utilizando HPLC-ECD, aunque los estudios no discriminaron entre el contenido medido de neurotransmisores versus la liberación de neurotransmisores5,6,7. Las monoaminas se liberan clásicamente en el espacio extracelular a través de la liberación vesicular dependiente de ^Ca2+9, y se reciclan de nuevo a través de su respectivo sistema de recaptación de la membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)^10,11. Por el contrario, los datos sugieren que estos transportadores son capaces de liberar o efluir monoaminas, ya que se sabe que las drogas de abuso como la anfetamina (AMPH) y la 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) liberan DA y 5-HT, respectivamente, a través de sus sistemas de transporte12,13,14,15,16,17 . Por lo tanto, una comprensión mecanicista adecuada de la dinámica de liberación de monoamina es crucial para desarrollar farmacoterapias específicas y específicas.

Se ha empleado una amplia gama de técnicas para estudiar la liberación de monoaminas, como la voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV)¹⁸, la microdiálisis in ^vivo13, la ^imagen19, la preincubación con monoaminas radiomarcadas20, la optogenética y, más recientemente, los sensores fluorescentes y la fotometría codificados ^{genéticamente21,22} . FSCV y la microdiálisis in vivo son las principales técnicas utilizadas para estudiar la liberación de monoamina. FSCV se utiliza para estudiar la liberación exocitótica estimulada de, principalmente, DA en cortes cerebrales agudos e in ^vivo23. Debido a que FSCV utiliza electrodos para estimular o evocar la liberación, la fuente principal de liberación de neurotransmisores es la liberación vesicular dependiente de ^Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdiálisis in vivo junto con la HPLC mide los cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares utilizando una sonda colocada en un área cerebral de ^{interés13,32}. Al igual que el FSCV, una limitación importante de la microdiálisis in vivo es la dificultad para determinar la fuente de liberación de neurotransmisores: liberación vesicular dependiente de ^Ca2+ o dependiente del transportador. Cabe destacar que ambos métodos permiten la medición directa de la liberación de monoamina. A través del reciente avance de la optogenética, la investigación demuestra la detección de la liberación de 5-HT y DA en un corto período de tiempo con una exquisita especificidad de tipo ^celular21,22. Sin embargo, estas estrategias requieren técnicas y equipos complejos y costosos, e indirectamente miden la liberación de monoamina, específicamente a través de la unión de monoamina a los receptores. Además, las monoaminas radiomarcadas también se utilizan para estudiar la dinámica de la monoamina. Las monoaminas radiomarcadas pueden estar precargadas en varios sistemas modelo, como células heterólogas que sobreexpresan cada transportador de monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuronas ^primarias20, sinaptosomas33,39,41^{, 42}, y cortes cerebrales ^agudos43,44. Sin embargo, la radiactividad supone un daño potencial para el experimentador, y los analitos marcados con tritio pueden no recapitular fielmente la dinámica endógena de la ^{monoamina45,46}. Los sistemas de superfusión combinados con métodos de detección fuera de línea como HPLC-ECD han permitido la detección de monoaminas de múltiples fuentes tisulares. Aquí, este protocolo proporciona como un método optimizado y de bajo costo, simple y preciso que utiliza cortes cerebrales agudos para medir directamente la liberación de monoamina basal endógena y estimulada.

Las rebanadas cerebrales agudas permiten probar hipótesis mecanicistas, principalmente porque preservan el microambiente anatómico in vivo y mantienen intactas las sinapsis47,48,49,50,51,52. En algunos estudios, se han utilizado cortes cerebrales agudos o tejido cerebral picado junto con una técnica de superfusión utilizando KCl para estimular la liberación mediada por ^Ca2+53,54,55,56. Los sistemas de superfusión han sido fundamentales para avanzar en la comprensión del campo de los mecanismos de liberación de neurotransmisores, incluidas las monoaminas. Sin embargo, estos sistemas son relativamente caros, y el número de cámaras disponibles para el análisis de tejidos oscila entre 4 y 12. En comparación, el método presentado aquí es económico, permite la medición de 48 muestras de tejido y puede refinarse para usar hasta 96 muestras de tejido. Cada pozo dentro de la placa de 48 pocillos contiene soportes de tejido que utilizan filtros para separar el producto liberado del tejido, y las monoaminas liberadas son recolectadas y analizadas por HPLC-ECD. Es importante destacar que este método permite la medición simultánea de la liberación de 5-HT, DA y NE de diferentes áreas del cerebro, como la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal después del tratamiento con agentes farmacológicos que modulan la liberación de monoamina. Por lo tanto, el experimentador puede responder a múltiples preguntas utilizando un sistema económico de múltiples pocillos que aumenta el número de muestras analizadas y, por lo tanto, reduce el número de animales utilizados.