成体マウスへの新生児マウス心臓マクロファージ移植

すべての実験は、実験動物の使用とケアのためのガイドに従って行われました。すべての動物の議定書は、機関動物のケアと使用委員会(IACUC)、ふワイ病院、中国医学アカデミーによって承認されました。手術部位の汚染を防ぐために、手順全体を通して無菌技術が必要です。 1. 新生児1日 Cx3cr1 GFP/+ マウスのアプリカル切除手術(C57BL/6 バックグラウンド) 麻酔 ケージからすべてのマウスの子犬を取り出し、きれいな乾燥した箱に入れます。 各マウスを氷の中に約2〜3分間埋め込みます。凍傷を防ぐために、氷とマウスの子犬の間にラテックスやガーゼなどの薄い障壁があることを確認してください。 青白い皮膚、四肢の動きの欠如、およびペダル反射の欠如の徴候を観察することによって十分な麻酔を識別する。 開 胸 麻酔を維持するために-20 °Cで一晩青銅の操作のプラットホームを予冷する。 麻酔をかけ、アイスボックスからマウスを取り出し、青銅の操作プラットフォームに置きます。医療用粘着テープを使用して、作動プラットフォーム上のサイン位置にマウスを固定します。 操作プラットフォームをマウスでステレオスコープの下に置きます。 ベタジンと70%アルコールを浸した準備パッドを使用して、または制度的な方針と一致してマウスの胸部を消毒する。 胸腔の第4肋間領域で1cmの切り傷を切り取り、心臓がアクセスされるまで微小手術ハサミを使用して肋間筋を分離して皮膚を切り開く。 心臓が機械的損傷を受けずに胸部から外装されるまで、2つの鉗子の助けを借りて胸と腹部を押してください。 小さな切開部の下と上の肋骨を、心臓を固定する自然な固定として設定します。 心室の頂点切除 左心室の頂点を見つけます。ステレオスコープ下で虹十次はさみを使用して心室の頂点組織の直径1mmをカットします。 左心室が露出していることを確認し、にじみ出る。 綿棒を使用して心臓を胸腔に軽く押し付けます。 8-0を使用して筋肉、肋骨、および皮膚を縫合するプロレン縫合糸。 操作後、マウスを十分に清掃してください。 手術後のケア 操作プラットフォームから37°Cの加熱毛布にマウスを移し、操作直後にボディを温めます。 自然呼吸の回復、肌の色の淡い色からピンクへの変化、手足の動きなど、マウスのアナビオシスを確認します。 回復したら、操作したマウスを母親に戻します。 必要に応じて、操作したマウスを母親のネスティング材料と混ぜ合わせたりします。注意:一度に母親からすべての1日の子犬を削除し、すべての子犬が回復した後、一度にそれらを返す必要があります。 2. 新生児心臓マクロファージ懸濁液の調製 注:これらすべての実験手順は、暗い場所で、無菌条件下で行われるべきです。 新生児 Cx3cr1GFP/+ マウスの心臓部を、頭蓋切除後1日収穫する Cx3cr1GFP/+マウスは、補助的切除の翌日に安楽死させる。過剰な二酸化炭素を使用し、マウスを順次切断して安楽死を適用します。 胸から心臓を取り出し、PBSで10cmの皿に浸します。 血管と残りの結合組織を心室から切り離します。耳介の付録と流出管を心臓から切り取ります。 心臓が拍動を止めた後、心臓をマイクロサージシカルハサミを用いてPBSバッファー内の1〜2mm3個に切り込む(図2A)。 新生児マウス心臓解離 収穫した心臓組織を、予熱酵素ミックス(材料表)の2.5mLを含むチューブに移し、チューブをしっかりと閉じます。 チューブを反転し、キャップを下にして配置します(図2B)。 新生児心臓解離プログラム(材料表)を実行します。 プログラムが完了したら、解離器からチューブを取り外します。 10Sの7.5 mLの1x DMEMをチューブに加えます。 懸濁液を15mL遠心管に移し、移す(図2C)。細胞懸濁液を300xgで5分間遠心分離する。 血液細胞溶解液1mLで細胞ペレットを再懸濁し、室温で2分間インキュベートする。 5~10mLのPBSバッファーを懸濁液に加え、遠心分離機を300xgで5分間加えます。 10SでDMEMの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。 新生児心臓マクロファージ分離 FACSによってGFP+ 新生児心臓マクロファージを並べ替える。10SのDMEMの500 μLを含む無菌の管で選別されたマクロファージを受け取る。 GFP+ マクロファージをカウントします (図 2D)。DMEMのマクロファージを、DMEMの200 μLあたり1 x 106 マクロファージの濃度で10Sで再中断し、後でインジェクションします。注:GFP+ マクロファージの数は、1つの新生児(およそ1 x 105)で小さいです。したがって、少なくとも10の新生児は、各成人マウス注射のための十分なマクロファージを得るために使用されるべきである。 3. 新生児心臓マクロファージ移植 左前冠動脈8の結紮により、成人(6-8週齢)の雄C57BL/6マウスに対して心筋梗塞手術を行う。 操作したマウスを37°Cの加熱毛布の上に置いて、回復します。 1 x 106 GFP+ 新生児心臓マクロファージを用いて200μLDMEMを、手術後(約6時間後)尾静脈 を介して 梗塞した成体マウスに静脈内に注入する。 マウスをクリーンケージに戻します。 4. 結果評価 射出効率の検証 手術マウスを麻酔し、心筋梗塞手術の7日後に心臓を収穫する。 あらかじめ冷却されたPBSバッファーに心臓を浸します。 心臓組織を4%ポリホルムアルデヒドで室温で72時間揺れで固定します。 ジメチルベンゼンおよびエタノールで心臓組織を脱水する。 パラフィンに心臓組織を埋め込み、厚さ5μmのセクションにスライスします。 標準免疫蛍光染色プロトコル1を実行する。心筋細胞をマークするにはα-アクチニンを使用してください。 移植を受けている心臓のGFP+ マクロファージを検出する。 標準免疫蛍光染色プロトコル1を実行する。α-アクチニンとpH3を使用して、それぞれ心筋細胞および細胞増殖をマークする(図3A)。 移植後の心臓修復評価 操作1の1ヶ月後に操作されたマウスに心エコー検査を使用する。 左心室の駆出率と異なるグループの分数短縮を比較して心機能を解析する(図3B)。 操作されたマウスを麻酔し、心臓を収穫する。 ステップ 4.1.2 から 4.1.5 を繰り返します。 マッソンの染色プロトコルを実行します。 マクロファージ注射後の梗塞領域を解析する(図3C)。