Yenidoğan Fare Kardiyak Makrofajların Yetişkin Farelere Nakli

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu’na uygun olarak gerçek yapılmıştır. Tüm hayvan protokolleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Fuwai Hastanesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi tarafından onaylandı. Cerrahi bölgenin kirlenmesini önlemek için işlem boyunca aseptik teknik gereklidir. 1. Yenidoğan 1 günlük Cx3cr1 GFP/+ farede apikal rezeksiyon işlemi(C57BL/6 arka plan) Anestezi Tüm fare yavrularını kafeslerden çıkar ve temiz bir kuru kutuya koy. Her fareyi yaklaşık 2-3 dakika boyunca buza gömün. Donma önlemek için buz ve fare yavrusu arasında lateks veya gazlı bez gibi ince bir bariyer olduğundan emin olun. Aşağıdaki belirtiler için gözlemleyerek yeterli anesteziyi tanımlayın: soluk cilt, uzuv hareketi eksikliği ve pedal refleksi eksikliği. Torakotomi Anestezinin korunmasına yardımcı olmak için bronz çalışma platformunu bir gecede -20 °C’de ön soğutma. Uyuşturulmuş fareyi buz kutusundan çıkar ve bronz bir çalışma platformuna koy. Fareyi tıbbi yapışkan bant kullanarak çalışma platformuna destek konumunda tutturun. Üzerinde fare olan işletim platformunu stereoskop altına koyun. Fare göğsünü betadin ve% 70 alkolle ıslatılmış bir hazırlık pedi kullanarak veya kurumsal politikaya uygun olarak dezenfekte edin. Göğüs boşluğunun dördüncü interkostal bölgesinde 1 cm’lik bir kesikle cildi inklüzyüne edin ve ardından kalbe erişilene kadar mikrocerrahi makas kullanarak interkostal kasları ayırın. Alternatif olarak, kalp herhangi bir mekanik hasar olmadan göğüs dışına çıkana kadar iki yabanarı yardımıyla göğsüne ve karnına bastırın. Kaburgaları kalbi hareketsiz hale getirmek için doğal bir fiksasyon olarak küçük kesiğin altına ve üstüne ayarlayın. Ventrikül apeks rezeksiyonu Sol ventrikülün tepesini bulun. Stereoskop altında iridektomi makası kullanarak 1 mm çapında ventriküler apeks doku kesin. Sol ventrikül odasının açıkta olduğunu onaylayın ve sızmaya başlayın. Pamuklu çubuk kullanarak kalbi yavaşça göğüs boşluğuna geri bastırın. 8-0 kullanarak kasları, kaburgaları ve cildi dikin Prolene dikişler. İşlemden sonra fareyi iyice temizleyin. Ameliyat sonrası bakım Operasyondan hemen sonra vücudu ısıtmak için fareyi çalışma platformundan 37 °C ısıtma battaniyesine aktarın. Aşağıdaki belirtileri gözlemleyerek farenin anabiyozunu onaylayın: spontan solunum restorasyonu, ten rengi soluktan pembeye ve uzuvların hareketi. Ameliyat edilen fareyi iyileştikten sonra annesine geri götürün. Ameliyat edilen fareyi gerekirse annesinin yuva malzemeleriyle bir katın.NOT: Tüm 1 günlük yavruların anneden aynı anda çıkarılması ve tüm yavrular kurtarıldıktan sonra hepsini aynı anda iade etmek önemlidir. 2. Yenidoğan kardiyak makrofaj süspansiyonunun hazırlanması NOT: Tüm bu deneysel işlemler karanlık bir yerde ve steril koşullarda yapılmalıdır. Apical rezeksiyondan 1 gün sonra yenidoğan Cx3cr1GFP/+ farenin kalbini hasat edin Apical rezeksiyondan bir gün sonra Cx3cr1GFP/+ faresini ötenazi edin. Fazla miktarda karbondioksit kullanın ve ötanazi uygulamak için farenin kafasını sırayla çekin. Kalbi göğüsten alın ve PBS ile 10 cm’lik bir tabağa daldırın. Damarları ve kalan bağ dokusunu ventriküllerden uzak kesin. Auriküler apandisiti kesin ve çıkış yolunu kalpten uzaklaştırın. Kalp durduktan sonra, mikrocerrahi makas kullanarak PBS tamponunda kalbi1-2 mm 3 parçaya bölün (Şekil 2A). Yenidoğan fare kalbi ayrışması Hasat edilen kalp dokusunu önceden ısıtılmış 2,5 mL enzim karışımı(Malzeme Tablosu)içeren bir tüpe aktarın ve tüpü sıkıca kapatın. Tüpü ters çevirin ve kapağı aşağı olacak şekilde yerleştirin (Şekil 2B). Yenidoğan kalp ayrışma programınıçalıştırın( Malzeme Masası ). Program tamamlandıktan sonra tüpü ayrıştırıcıdan ayırın. Tüpe FBS ile 7,5 mL 1x DMEM ekleyin. Süspansiyonu filtreleyin ve 15 mL santrifüj tüpüne aktarın(Şekil 2C). Hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleyin. Hücre peletini 1 mL kan hücresi liziz çözeltisinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın. Süspansiyona 5-10 mL PBS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüj ekleyin. Hücre peletini FBS ile 1 mL DMEM’de yeniden sunun. Yenidoğan kardiyak makrofaj izolasyonu GFP+ yenidoğan kardiyak makrofajları FACS’e göre sıralayın. Sıralanmış makrofajları% 10 FBS ile 500 μL DMEM içeren steril bir tüpe alın. GFP+ makrofajları sayın (Şekil 2D). DMEM’deki makrofajı, daha sonra enjeksiyon için 200 μL DMEM başına 1 x10 6 makrofaj konsantrasyonunda% 10 FBS ile yeniden depoleyin.NOT: Bir yenidoğanda GFP+ makrofaj sayısı azdır (yaklaşık 1 x 105); bu nedenle, her yetişkin fare enjeksiyonu için yeterli makrofaj elde etmek için en az 10 yenidoğan kullanılmalıdır. 3. Yenidoğan kardiyak makrofaj nakli Sol ön koroner arter 8’in ligasyonu ile yetişkin (6-8 haftalık) erkek C57BL/6 fareye miyokard enfarktüsü operasyonugerçekleştirin. Çalıştırılan fareyi iyileşene kadar 37 °C ısıtmalı battaniyeye koyun. Ameliyattan sonra (yaklaşık 6 saat sonra) kuyruk damarı üzerinden enfarktüslü yetişkin fareye 1 x10 6 GFP+ yenidoğan kardiyak makrofajlı 200 μL DMEM enjekte edin. Fareyi temiz bir kafese geri gönder. 4. Sonuç değerlendirmesi Enjeksiyon verimliliği doğrulaması Ameliyat edilen fareyi uyuşturun ve miyokard enfarktüsü operasyonundan 7 gün sonra kalbi hasat edin. Kalbi önceden soğutulmuş PBS arabelleğine daldır. Kalp dokusunu oda sıcaklığında 72 saat boyunca %4 poliformaldehit ile çalkalayarak sabitlayın. Kalp dokusunu dimetilbenzen ve etanolde susuzlaştırın. Kalp dokusunu parafin içine katıştırın ve 5 μm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Standart immünoresans boyama protokolünügerçekleştirin 1. Kardiyomiyositleri işaretlemek için α-actinin kullanın. Transplantasyon alan kalpteki GFP+ makrofajları tespit edin. Standart immünoresans boyama protokolünügerçekleştirin 1. Sırasıyla kardiyomiyositleri ve hücre çoğalmasını işaretlemek için α-actinin ve pH3 kullanın (Şekil 3A). Nakil sonrası kardiyak onarım değerlendirmesi Operasyondan bir ay sonra çalıştırılan farede ekokardiyografi kullanın1. Sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunu ve fraksiyonel kısalmayı farklı gruplar halinde karşılaştırarak kardiyak fonksiyonu analiz edin (Şekil 3B). Ameliyat edilen fareyi uyuşturun ve kalbi hasat edin. 4.1.2-4.1.5 adımlarını yineleyin. Masson’un boyama protokolünü gerçekleştirin. Makrofaj enjeksiyonundan sonra enfarktüs alanını analiz edin (Şekil 3C).