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生物化学

Incorporazione ottimizzata di analoghi degli acidi grassi alchinici per il rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/62107
, ,
1Department of Biology,University of Waterloo

Summary

Lo studio dell’acilazione grassa ha importanti implicazioni nelle interazioni proteiche cellulari e nelle malattie. Qui viene presentato un protocollo modificato per migliorare il rilevamento della chimica dei clic delle proteine acilate grasse, che può essere applicato in vari tipi di cellule e combinato con altri saggi, tra cui pulse-chase e spettrometria di massa.

Abstract

L’acilazione grassa, l’aggiunta covalente di acidi grassi saturi ai substrati proteici, è importante nella regolazione di una miriade di funzioni cellulari oltre alle sue implicazioni nel cancro e nelle malattie neurodegenerative. I recenti sviluppi nei metodi di rilevamento dell’acilazione grassa hanno consentito il rilevamento efficiente e non pericoloso delle proteine acilate grasse, in particolare attraverso l’uso della chimica del clic con etichettatura bio-ortogonale. Tuttavia, il rilevamento della chimica dei clic può essere limitato dalla scarsa solubilità e dai potenziali effetti tossici dell’aggiunta di acidi grassi a catena lunga alla coltura cellulare. Qui è descritto un approccio di etichettatura con consegna ottimizzata utilizzando acidi grassi saponificati in combinazione con BSA privo di acidi grassi, nonché mezzi delipidati, che possono migliorare il rilevamento di proteine acilate grasse difficili da rilevare. Questo effetto è stato più pronunciato con l’analogo alchil-stearato, 17-ODYA, che è stato l’analogo degli acidi grassi più comunemente usato nel rilevamento della chimica del clic delle proteine acilate. Questa modifica migliorerà l’incorporazione cellulare e aumenterà la sensibilità al rilevamento di proteine acilate. Inoltre, questo approccio può essere applicato in una varietà di tipi di cellule e combinato con altri saggi come l’analisi pulse-chase, l’etichettatura isotopica stabile con aminoacidi in coltura cellulare e la spettrometria di massa per la profilazione quantitativa delle proteine acilate grasse.

Introduction

L’acilazione grassa comporta l’aggiunta covalente di acidi grassi alle proteine ed è ben nota per la sua importanza nel promuovere le interazioni proteina-membrana, ma ha anche dimostrato di promuovere interazioni proteina-proteina, cambiamenti conformazionali e regolare i siti catalitici degli enzimi1,2,3,4,5,6,7 . L’acilazione grassa è emersa come potenziale bersaglio farmacologico in una miriade di malattie, tra cui infezioni, cancro, infiammazione e neurodegenerazione, dove sono state documentate interruzioni nella palmitoilazione8,9,10,11,12,13. Ciò è stato principalmente stimolato dallo sviluppo di nuovi metodi di rilevamento chimico, che hanno permesso l’identificazione su larga scala di bersagli proteici S-acilati.

L’acilazione grassa può includere una varietà di modifiche che coinvolgono l’aggiunta covalente di acidi grassi saturi e insaturi, ma in genere si riferisce alla N-miristoilazione e alla S-acilazione. La N-miristoilazione si riferisce all’aggiunta di acido miristico alle glicine N-terminali sia co-traduzionalmente su polipeptidi nascenti che post-traduzionalmente su glicine N-terminali di nuova esposizione a seguito di scissione proteolitica2,14. La N-miristoilazione avviene attraverso un legame ammidico irreversibile. D’altra parte, la S-acilazione si riferisce tipicamente all’aggiunta reversibile di acidi grassi a catena lunga ai residui di cisteina attraverso un legame tioestere. La forma più comune di questa modifica include l’incorporazione di palmitato e, quindi, è comunemente indicata come S-palmitoilazione, o semplicemente palmitoilazione11,15. In molti modi, la S-palmitoilazione è simile alla fosforilazione. È dinamico, regolato enzimaticamente e si dimostra altamente trattabile.

Fino all’ultimo decennio, lo studio dell’acilazione grassa era ostacolato da metodi di rilevamento limitati, che richiedevano acidi grassi marcati radioattivamente. Ciò presentava diversi svantaggi, tra cui costi, problemi di sicurezza e tempi di rilevamento molto lunghi. Tipicamente, il palmitato triziato o iodato è stato utilizzato per il rilevamento dell’acilazione S16. Il palmitato triziato richiedeva lunghi periodi di rilevamento con film di autoradiografia, che possono richiedere settimane o mesi. Mentre [125I] gli analoghi degli acidi iodo-grassi hanno ridotto i tempi di rilevamento, ha presentato un rischio per la sicurezza molto più elevato e ha richiesto uno stretto monitoraggio della tiroide degli sperimentatori. Inoltre, questi metodi non erano quantitativi, quindi, limitando la capacità di misurare la palmitoilazione dinamica e richiedendo anche tempo per l’installazione e la pulizia a causa dei dispositivi di protezione individuale aggiuntivi e del monitoraggio radioattivo. Infine, le etichette radioattive non erano adatte per studi proteomici e in genere limitate al rilevamento a basso rendimento di specifiche proteine di interesse. Man mano che venivano rilevati più substrati e, inevitabilmente, venivano identificati gli enzimi che mediano ogni modifica, era chiaro che erano necessari nuovi metodi di rilevazione17,18,19,20,21. Quasi contemporaneamente, sono sorti diversi nuovi metodi per il rilevamento di proteine acilate grasse. Il primo sfrutta la reversibilità e la reattività del legame tioestere della S-acilazione. Il saggio di scambio acil-biotina (ABE) sostituisce chimicamente il palmitato con la biotina per il successivo pulldown di proteine S-acilate utilizzando perle di avidina agarosio e il rilevamento diretto da parte di western blot22,23,24. Successivamente, è stata sviluppata l’etichettatura bio-ortogonale degli acidi grassi e l’aggiunta chemioselettiva a tag o maniglie che includevano l’uso della legatura Staudinger e della chimica dei clic25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Infine, analogamente all’ABE, la cattura assistita da resina acile (RAC) sostituisce essenzialmente i siti S-acilati con perle tiolo-reattive per la cattura e il rilevamento di proteine S-acilate34,35. Insieme, i saggi basati sullo scambio e sulla chimica dei clic hanno fornito metodi più efficienti e sensibili di rilevamento dell’acilazione e purificazione dell’affinità per l’analisi a valle e hanno successivamente portato alla scoperta di migliaia di proteine S-acilate8,36.

Il termine chimica del clic comprende un gruppo di reazioni chimiche, ma più comunemente si riferisce al meccanismo di reazione di cicloaddizione azido-alchinica catalizzata da Cu(I) [3+2] tra un gruppo alchilico e un gruppo azido27,28,37. In particolare, nel caso dell’acilazione grassa, la chimica dei clic comporta la rilevazione di S-palmitoilazione o N-miristilazione incorporando bio-ortogonale 16-carbonio alchinil-palmitato (acido 15-esadecinoico; 15-HDYA) o il 14-carbonio alchil-miristato (acido 13-tetradecinoico; 13-TDYA), rispettivamente, nelle cellule per etichettare proteine endogenamente acilate28 . Dopo la lisi cellulare e l’immunoprecipitazione della proteina di interesse, viene eseguita una reazione chimica a clic (legame covalente tra un alchino e un azide) per legare una sonda di affinità, tipicamente biotina, per il rilevamento da parte di western blot28,37. In alternativa, la chimica dei clic può essere eseguita sul lisato cellulare totale e le proteine acilate grasse possono essere purificate per affinità per l’identificazione mediante spettrometria di massa. La reazione chimica iniziale con azido-biotina ha aumentato la selettività e la sensibilità del rilevamento oltre un milione di volte rispetto alla radioattività2. Un altro vantaggio della chimica dei clic è che può essere combinato con altri metodi di etichettatura classici, come l’analisi pulse-chase del turnover proteico utilizzando l’azido-omoalanina per l’analisi quantitativa38. Inoltre, le sonde fluorescenti possono essere utilizzate al posto della biotina o di altre sonde biochimiche, come i tag FLAG o Myc, al fine di esaminare la localizzazione delle proteine16,28,39.

Nonostante la relativa facilità d’uso della chimica dei clic, il rilevamento può essere limitato dalla bassa solubilità e dalla potenziale tossicità dell’uso di acidi grassi liberi a catena lunga nella coltura cellulare40. In particolare, nonostante la preferenza del palmitato durante la S-acilazione per la maggior parte delle proteine, molti studi hanno utilizzato lo stearato a 18 atomi di carbonio (acido 17-ottadecinoico – 17-ODYA) piuttosto che il palmitato (15-HDYA) per rilevare le proteine S-acilate a causa della sua disponibilità commerciale e del costo relativamente basso. Tuttavia, 17-ODYA è molto insolubile e richiede particolare attenzione quando viene utilizzato. Inoltre, la chimica dei clic può richiedere una preparazione e una conservazione sfumate delle sostanze chimiche. Qui, il protocollo descrive un approccio di etichettatura, che ottimizza la consegna utilizzando la saponificazione degli acidi grassi, la consegna con BSA priva di acidi grassi e il siero bovino fetale delipidato (FBS) per aumentare la solubilità e bypassare i potenziali effetti tossici dell’aggiunta di acidi grassi liberi alle cellule28. Questo metodo funziona in una varietà di tipi di cellule ed è stato utilizzato anche in animali vivi28.

Protocol

1. Coltura cellulare Per integrare DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) per la coltura cellulare, aggiungere il 10% di siero bovino fetale (FBS), 1x penicillina-streptomicina, 2 mM di L-glutammina e 100 mM di piruvato di sodio (1% vol / vol). Placcare circa 5 x 105 cellule HEK293T / pozzetto di un piatto di coltura tissutale a 6 pozzetti e crescere per 18 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C con il 5% di CO2 per raggiungere il 75% -80% di confluenza. Privazione di siero di acidi grassi Per preparare i supporti di etichettatura, preparare DMEM come sopra (passaggio 1.1) senza FBS al 10%. Sostituire FBS con FBS rivestito di destrano-carbone (DCC-FBS) al 5%. Preriscaldare a 37 °C prima dell’uso. Lavare delicatamente le cellule con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a temperatura ambiente e sostituirle con mezzi di etichettatura.NOTA: le cellule HEK293T si staccano facilmente dalle piastre di coltura dei tessuti. Fare attenzione quando si lavano le celle e si sostituiscono i supporti. Ridurre al minimo l’agitazione durante il trasferimento da e verso l’incubatore il più possibile. Riportare le cellule all’incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e incubare circa 45 min (minimo 15 min è efficace), fino a 60 min, prima di procedere con l’etichettatura metabolica con acidi grassi. 2. Preparazione e saponificazione degli analoghi degli acidi grassi Preparare in anticipo le soluzioni madre di acidi grassi alchinili solubilizzando in DMSO per raggiungere le seguenti concentrazioni e conservare a -20 °C. Scongelare a temperatura ambiente secondo necessità. Conservare i preparati per le loro migliori prestazioni sotto N2 o Ar.Alchil-miristato (acido 13-tetradecinoico, 13-TDYA): 25 mMPalmitato di alchil (acido 15-esadecinoico; 15-HDYA): 100 mMAlchil-stearato (acido 17-ottadecinoico; 17-ODYA): 100 mM Per preparare il 20% di BSA senza acidi grassi (FAFBSA), pesare 2 g di FAFBSA in un tubo monouso da 50 ml. Portare fino a 10 ml con DMEM preriscaldato (37 °C). Mescolare per rotazione end-over-end o per vortice e mettere in un bagno d’acqua a 37 °C per sciogliere completamente FAFBSA. Utilizzare un filtro da 0,2 μm per filtrare la sterilizzazione del mezzo. Aliquota in volumi di circa 1 mL e stoccaggio a -20 °C. Scongelare secondo necessità e riscaldare a 37 °C a bagnomaria prima dell’uso. Per migliorare la solubilità degli acidi grassi e degli analoghi degli acidi grassi, saponificare incubando con il 20% di eccesso molare di idrossido di potassio (KOH) in flaconcini di reazione conica di vetro da 3 ml.NOTA: Questi flaconcini consentono al sale di rimanere solubile assicurandosi che il FAFBSA non si congeli dal calore elevato. L’uso del vetro impedisce inoltre agli acidi grassi di attaccarsi alla plastica. Pipettare almeno 2 μL di analogo dell’acido grasso alchinile direttamente sul fondo di un flaconcino di reazione conica da 3 mL. Preparare 2 μL di lipidi per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti utilizzata (vedere Tabella 1).NOTA: A causa dell’idrofobicità degli acidi grassi, è meglio rivestire la punta della pipetta disegnando il volume desiderato più volte prima di erogarlo nel flaconcino di reazione. Diluire 1 M KOH a concentrazioni pari al 20% di eccesso molare dell’etichetta degli acidi grassi alchilici (30 mM per 13-TDYA e 120 mM per 15-HDYA e 17-ODYA). Pipettare una quantità uguale di KOH diluito (1 μL: 1 μL di acido grasso: KOH) vicino al fondo del flaconcino di reazione sul bordo del vetro, in modo tale che il volume erogato del KOH si mescoli con l’acido grasso. Chiudere il coperchio del flaconcino e picchiettare delicatamente per miscelare le soluzioni.NOTA: La miscela può solidificarsi rapidamente, specialmente con lunghezze crescenti della catena idrocarburica dell’acido grasso. Fare attenzione a non pipettare il solido (cioè, non mescolare con il pipettaggio). Riscaldare il flaconcino di reazione a 65 °C per circa 5 minuti, o non appena l’acido grasso è incorporato (la soluzione diventa limpida).NOTA: Gli acidi grassi con un numero maggiore di atomi di carbonio e una ridotta solubilità, come lo stearato (17-ODYA), possono richiedere tempi di incubazione più lunghi per essere completamente incorporati nel KOH a 65 °C. Aumentare la temperatura a 70 °C, se necessario. Un bagno d’acqua è il migliore. Fare attenzione che il liquido non evapori troppo. Una volta che gli acidi grassi sono andati in soluzione e non rimangono solidi visibili, la pipetta ha preriscaldato il 20% FAFBSA in modo tale che il rapporto di volume degli acidi grassi: KOH: FAFBSA sia 1: 1: 50 per ottenere una concentrazione finale di 20x acidi grassi alchinili legati al BSA. Mescolare pipettando su e giù. La soluzione appare in genere chiara senza solidi visibili.NOTA: In genere, eventuali piccoli solidi andranno in soluzione dopo l’incubazione a 37 °C. Incubare l’acido grasso e FAFBSA per 15 minuti a 37 °C.NOTA: L’etichetta saponificata a questo punto è stabile oltre i 15 min.   Volume totale dei supporti (mL) Acido grasso o analogo degli acidi grassi (μL) KOH (μL) 20% FAFBSA (μL) Volume totale dell’etichetta saponificata coniugata con BSA (μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 Tabella 1: Rapporti di etichettatura degli acidi grassi saponificati. Volumi sperimentali di acidi grassi, KOH e FAFBSA per la saponificazione dell’etichetta degli acidi grassi in base al volume di mezzi utilizzati. Come controllo, ripetere il passaggio 2.3. con acidi grassi senza etichetta alchinica. Etichettare le cellule con 1/20 di volume del coniugato acido grasso-BSA 20x direttamente sul mezzo di fame (tipicamente, 100 μL in 2 mL di media/cellule) per ottenere una concentrazione finale dell’1% di BSA e 25 μM per l’alchil-miristato, o 100 μM per alchil-palmitato e alchil-stearato.NOTA: per ridurre al minimo la quantità di disturbo fisico alle cellule collegate, formare una goccia sulla punta della pipetta vicino alla superficie del supporto invece di pipettare direttamente nel supporto. Se si utilizzano inibitori dell’acilazione, aggiungere almeno 15 minuti prima degli acidi grassi etichettati. I tempi possono variare a seconda delle cellule o dell’inibitore utilizzato. È stato raccomandato di utilizzare la saponificazione anche per questo passaggio28. Per confronto, aggiungere lipidi non saponificati pipettando 2 μL (o equivalente a saponificato in volume) di acido grasso non etichettato direttamente nel mezzo di fame. Riposizionare le cellule nell’incubatrice e incubare per 3-6 ore.NOTA: potrebbe essere necessario determinare i tempi di etichettatura ottimali per ciascun tipo di cellula o condizione sperimentale. Tempi di incubazione più lunghi possono potenzialmente portare alla scomposizione degli acidi grassi per β-ossidazione e/o incorporazione in altri gruppi lipidici, come i fosfolipidi28. Lavare delicatamente le celle con 1x PBS a temperatura ambiente. Raccogliere e lisare le cellule con 500 μL di tampone ripA (Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) modificato (RIPA) tampone (0,1% SDS, 50 mM di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-etanosolfonico (HEPES) pH 7,4, 150 mM NaCl, detergente non denaturante all’1%, desossicolato di sodio allo 0,5%, 2 mM MgCl2 con fluoruro di fenilmetilsulfonile appena aggiunto (PMSF) e 10 μg/μL di Pepstatina A (o cocktail di inibitori completi della proteasi privo di EDTA)) dondolando i lisati per 15 minuti a 4 °C. Centrifugare i lisati a 16.000 x g per 10 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante in tubi microcentrifuga da 1,7 mL e conservare a -20 °C fino a quando non si procede con la reazione del clic.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I lisati sono stabili a -20 °C fino a 1 mese. Tuttavia, si consiglia di procedere con la reazione del clic in modo tempestivo. Quantificare le concentrazioni proteiche utilizzando un test appropriato secondo il protocollo del produttore, come un test compatibile con il detergente (DC). 3. Fare clic sulla reazione sui lisati cellulari Preparare i reagenti per la chimica dei clic. Sciogliere l’ammina tris-(benziltriazolilmetil) (TBTA) in DMSO a 2 mM. Conservare in piccole aliquote con essiccante a -20 °C per un massimo di 2-3 mesi. Meglio conservato sotto N2 o Ar. Sciogliere CuSO4 in acqua ddH2O per raggiungere 50 mM. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi. Sciogliere la tris-carbossietilfosfina (TCEP) in acqua ddH2O a 250 mM. Conservare al buio a 4 °C ed effettuare diluizioni fresche da 50 mM appena prima della reazione del clic. Preparare 2 mM azide in DMSO. Conservare in piccole aliquote con essiccante a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Meglio conservato sotto N2 o Ar.NOTA: È stato osservato che i prodotti con tre o più gruppi di polietilenglicoli hanno funzionato meglio con la biotina. Portare 50-100 μg di lisati proteici in tubi microcentrifuga da 1,7 mL allo stesso volume utilizzando lo stesso tampone di lisi di cui sopra.NOTA: Mantenere il volume di reazione il più piccolo possibile (20-100 μL). Aggiungere il solfato di sodio dodecile (SDS) a ciascun campione per ottenere una concentrazione finale dell’1%. Preparare un mix principale di reagenti click in modo che le concentrazioni finali dopo l’aggiunta ai lisati siano: 100 μM TBTA (2 mM stock), 1 mM CuSO4, (50 mM stock) 1 mM TCEP (50 mM stock) e 100 μM azide probe (2 mM stock). Combinare le soluzioni stock di conseguenza (cfr. tabella 2).NOTA: l’ordine è importante. Mescolare completamente dopo l’aggiunta di ciascun componente. Aggiungere i volumi appropriati del mix master nei lisati. Mescolare pipettando su e giù. Incubare per 30 minuti al buio a bagnomaria a 37 °C. Agitare/mescolare di tanto in tanto. Reazione totale vol (μL) Proteina vol. (μL) TBTA (2 mM) (μL) CuSO4 (50 mM) (μL) TCEP (50 mM) (μL) azido probe (2 mM) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 Tabella 2: Fare clic sui rapporti di volume di reagenti e proteine. Volumi sperimentali dei reagenti chimici click e corrispondenti concentrazioni di stock, oltre ai volumi di campioni proteici. 4. Fare clic sulla reazione sulle proteine immunoprecipitate In alternativa, è possibile eseguire la reazione click sulle proteine immunoprecipitate (IP) dentro o fuori le perline.NOTA: In genere, l’esecuzione del clic sulle perline porta al minimo background ed è la cosa migliore quando si testano nuove proteine di interesse. Trasfettano le cellule per la proteina di interesse, in questo caso, l’huntingtina C-terminale (HTT) miristoilata wildtype fusa in GFP (myr-ctHTT-GFP) e ctHTT-GFP con una sostituzione G2A, utilizzando la coprecipitazione del DNA del fosfato di calcio, come precedentemente descritto41. Piastra 2,5 x 105 cellule / pozzetto in piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti e crescono durante la notte fino a ~ 70-80% di confluenza. Preparare la miscela di DNA aggiungendo 2,5 μg di DNA in 10 μL con 99,75 μL di grado molecolare H2O a un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL. Quindi, aggiungere 15,25 μL di CaCl2 a goccia al mix di DNA. Aggiungere la miscela DNA/CaCl2 in un tubo separato contenente 125 μL 2x soluzione salina tamponata HEPES (HBS, pH 7,0) in modo goccioso con la miscelazione. Aggiungere lentamente la miscela DNA/CaCl2/HBS alle cellule. Dopo 2-4 ore, sostituire il supporto e incubare durante la notte. Procedere con l’etichettatura dai passaggi 1.3-2.8. Preparare volumi uguali di 500 μg di proteine nel tampone di lisi. Eseguire IP incubando con coniglio anti-GFP per ctHTT-GFP ruotando durante la notte a 4 °C. Aggiungere 15-20 μL di perline di proteina G pre-bilanciate con tampone di lisi a ciascun tubo e lasciare che reagisca end-over-end a 4 °C per 3 ore. Lavare le perline con tampone di lisi e risospescere in 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES buffer. Riscaldare le perline a 80 °C per 15 minuti e invertire i tubi o agitare circa ogni 5 minuti. Ruotare brevemente i tubi e tornare a 80 °C. Raccogliere il surnatante contenente le proteine mentre i campioni sono ancora caldi.NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni immunoprecipitati possono essere conservati a -20 ° C o -80 ° C, se non utilizzati immediatamente per la chimica del clic. Lasciare che 43 μL del surnatante reagiscano con una miscela master di reagenti click da 7 μL. Procedere con la reazione come indicato al punto 3.2.3. 5. SDS-PAGE e western blotting Arrestare la reazione e denaturare aggiungendo 1x tampone di carico del campione contenente 25 mM di ditiotreitolo (DTT) e riscaldare a 95 °C per 5 minuti.NOTA: è possibile utilizzare fino a 100 mM DTT28. Non usare β-mercaptoetanolo con proteine S-acilate in quanto può idrolizzare i legami tioesteri e rimuovere l’analogo dell’acido grasso cliccato. Ruotare brevemente verso il basso i campioni. Separare le proteine con SDS-PAGE su un gel di poliacrilammide, in duplicati.NOTA: Sono necessari due gel per il trattamento alcalino con KOH per confermare la presenza di legami tioesteri. Se si utilizza una sonda azide fluorescente, l’acilazione può essere rilevata in gel o dopo il trasferimento utilizzando il canale di eccitazione indicato. Trasferire su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF) (attivate in metanolo e risciacquate in ddH2O – 5 min ciascuna) con apparato di trasferimento semi-secco a 25 V, 1,0 A (costante) per 30 min. Dopo aver brevemente risciacquato le membrane con ddH2O, immergere una membrana replicata in 0,1 M KOH in metanolo / acqua (9: 1 v / v) e l’altra in 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 in metanolo / acqua (9: 1 v / v) come controllo non alcalino per 60 minuti a temperatura ambiente con dondolo delicato. Risciacquare brevemente le membrane in acqua ddH2O, seguito da 6 volte di 5 minuti di lavaggio in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween 20).NOTA: Lavare accuratamente. Bloccare le membrane durante la notte in un tampone di blocco del latte scremato al 5% (1x PBS, 0,1% Tween20). 6. Esegui western blot Dove indicato, sonda con Streptavidina marcata fluorescentemente (1:5000) e controllo del carico, anti-GAPDH rodamina (1:5000) in tampone di blocco BSA al 5% (0,01% SDS, 1x PBS, 0,1% Tween20) a temperatura ambiente per 45-60 min con dolce oscillazione, al buio. Sondare la macchia proteica immunoprecipiata prima con l’anticorpo primario anti-GFP nel tampone bloccante del latte scremato al 5%, quindi con gli anticorpi secondari appropriati nel 5% di BSA come nella fase 6.1. Lavare le membrane per 5 minuti in PBS-T (1x PBS, 0,1% Tween20) per un totale di quattro ripetizioni e risciacquare con acqua ddH2O prima dell’imaging.

Representative Results

La differenza nell’efficienza di etichettatura tra acidi grassi alchilici saponificati e non saponificati (non sap) per il rilevamento della chimica dei clic può essere visualizzata e confrontata dall’intensità del segnale delle proteine acilate grasse attraverso western blot (Figura 1). Un effetto notevole è stato osservato con l’aumento della lunghezza delle catene aciliche. Nelle cellule etichettate con alchil-stearato (alk-stear), la saponificazione dell’acido grasso e la somministrazione con BSA per l’etichettatura metabolica hanno aumentato drasticamente il rilevamento del segnale proteico S-acilato attraverso la chimica dei clic e il rilevamento da parte di una sonda fluorescente azido (Figura 1, a destra), suggerendo un aumento complessivo dell’incorporazione cellulare dell’etichetta dell’acido grasso alchinile. Al contrario, non è stata osservata alcuna differenza evidente nelle cellule trattate con l’acido grasso più corto e solubile, l’alchil-miristato (alk-myr; acido 13-tetradecinoico o 13-TDYA). Le cellule marcate con alchil-palmitato (Figura 1, al centro) hanno mostrato un aumento intermedio dell’etichetta rispetto all’alchil-miristato (13-TDYA), ma inferiore all’alchil-stearato. È importante sottolineare che il trattamento delle membrane PVDF con 0,1 M KOH ha in gran parte rimosso le etichette degli acidi grassi dalle cellule incubate con alchil-palmitato e alchil-stearato, confermando che la maggior parte del segnale era attraverso un legame estere o tioestere (Figura 1, pannelli centrali e destri, in basso). Come previsto, l’incorporazione di alchil-miristato era per lo più resistente agli alcali (Figura 1, a sinistra, pannelli inferiori), a causa dell’attaccamento del miristato alle proteine attraverso un legame ammidico. La Figura 2 dimostra la versatilità e la sensibilità della chimica dei clic per rilevare l’acilazione grassa delle proteine immunoprecipitate. Le cellule HEK293T sono state trasfettate con huntingtina miristoilata C-terminale (HTT) fusa in GFP (myr-ctHTT-GFP) ed etichettata con alchil-miristato, come descritto in precedenza18. Dopo l’immunoprecipitazione, ctHTT-GFP è stato rilasciato dalle perline e sottoposto alla chimica del clic insieme ai lisati. Non solo la miristoilazione del myr-ctHTT-GFP wildtype (WT) è stata rilevata negli immunoprecipiti, ma è stata fortemente rilevata nei lisati, mentre la mutazione G2A ha completamente bloccato la miristoilazione del ctHTT-GFP (Figura 2). Figura 1: Rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic. Le cellule HEK293T sono state incubate con gli acidi grassi indicati direttamente (non linfa) o dopo saponificazione (linfa) e incubazione con la proteina vettore BSA, come descritto nel protocollo 2.1-2.7. Gli acidi grassi alchinil sono stati collegati all’azide fluorescente sottoponendo 100 μg di lisati proteici alla chimica dei clic, separati da SDS-PAGE e trasferiti alle membrane PVDF. Dopo il trattamento con 0,1 M Tris pH 7,0 o 0,1 M KOH, per invertire i legami tioesteri, è stata rilevata l’acilazione grassa utilizzando un azide fluorescente. GAPDH è stato utilizzato come controllo del carico; anti-GAPDH rodamina (1:5.000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Rilevazione di ctHTT-GFP N-miristoilato utilizzando la chimica dei clic. Le cellule HEK293T sono state trasfettate con forma C-terminale troncata (ct) e miristoilabile di HTT (myr-ctHTT-GFP) ed etichettate con alchil-miristato. È stata inclusa una forma non miristoilabile con la glicina essenziale sostituita con un’alanina (G2A). Dopo la raccolta e la lisi, ctHTT-GFP è stato immunoprecipitato utilizzando anti-GFP di capra. I lisati sono stati sottoposti a reazioni chimiche a scatto (a sinistra) e immunoprecipitati dopo il rilascio dalle perline. La miristoilazione è stata rilevata utilizzando Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP è stato rilevato utilizzando coniglio anti-GFP in combinazione con anti-coniglio Alexa 488. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Schema del flusso di lavoro del protocollo sperimentale. Schema del flusso di lavoro delle principali fasi sperimentali del protocollo. Si notano diversi punti in cui il protocollo può essere messo in pausa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’aggiunta diretta di acidi grassi alle cellule in coltura può provocare insolubilità, precipitazione dei lipidi e lipotossicità40. Di conseguenza, l’aggiunta di acidi grassi direttamente alle cellule può non solo comportare uno scarso assorbimento cellulare e una bassa disponibilità dell’etichetta degli acidi grassi, ma anche una diminuzione del numero di cellule vitali per l’analisi a valle, nonché l’attivazione di percorsi fuori bersaglio. Tuttavia, molti protocolli di etichettatura metabolica per il rilevamento della chimica dei clic comportano l’aggiunta diretta di acidi grassi e un gran numero di studi palmitoil-proteoma che utilizzano il rilevamento della chimica dei clic per datare raramente saponificare le etichette degli acidi grassi o incubarle con BSA8,36. È importante considerare il fatto che l’efficienza e la sensibilità del rilevamento della chimica dei clic delle proteine acilate di grasso dipendono da un sufficiente assorbimento cellulare degli analoghi degli acidi grassi. Pertanto, è ragionevole ipotizzare che molte proteine S-acilate possano essere sfuggite al rilevamento negli studi proteomici a causa di una bassa disponibilità delle etichette degli acidi grassi da scarsa incorporazione nelle cellule, specialmente quando è stato utilizzato l’acido grasso a catena più lunga 17-ODYA. 17-ODYA, o alchil-stearato, è stata l’etichetta ampiamente utilizzata di scelta per diversi studi a causa della sua disponibilità commerciale e del suo uso precoce8,36. Tuttavia, i risultati di questo protocollo dimostrano che la saponificazione del 17-ODYA si traduce nel maggiore aumento del rilevamento di proteine S-acilate, rispetto agli acidi grassi a catena più corta come palmitato o miristato. Pertanto, ripetere questi esperimenti con etichette saponificate può produrre ulteriori substrati di S-acilazione che potrebbero essere stati precedentemente trascurati. Inoltre, mentre la maggior parte delle palmitoiltransferasi preferisce il palmitato per la S-acilazione, alcuni hanno preferenze per altre lunghezze di acidi grassi come lo stearato15,38,44. Inoltre, alcune proteine o anche siti specifici all’interno delle proteine preferiscono un acido grasso rispetto ad un altro15,45. Pertanto, gli studi che utilizzano 17-ODYA possono avere una propensione verso le proteine S-acilata con stearato, non palmitato, mentre sottorappresentano anche quelle proteine a causa della minore rilevazione.

La migliore efficienza di etichettatura metabolica per la chimica dei clic si basa sulla saponificazione dei lipidi e sull’incubazione con passaggi FAFBSA, nonché sull’FBS delipidato. Tutti gli acidi grassi devono essere completamente saponificati in KOH senza che rimangano solidi visibili prima di procedere con l’incubazione con FAFBSA. Questo può essere un passo difficile e il tempismo è cruciale. Dopo che gli acidi grassi saponificati sono andati in soluzione a 65 °C, aggiungere immediatamente BSA caldo poiché un ulteriore riscaldamento causerà l’evaporazione del DMSO dagli acidi grassi. Inoltre, l’etichetta saponificata inizierà a ri-solidificarsi non appena inizierà a raffreddarsi. Pertanto, il FAFBSA deve essere caldo e aggiunto rapidamente dopo che il sale è diventato solubile. Le fiale di reazione del vetro e la loro forma sono importanti per questo passaggio. Permettono al lipide saponificato di essere abbastanza caldo da rimanere solubile, mentre abbastanza freddo da garantire che il FAFBSA non si congeli. Anche una miscelazione sufficiente tramite pipettaggio è importante in questa fase per garantire una soluzione omogenea per l’etichettatura.

I reagenti per la chimica del clic devono essere conservati correttamente, in genere con essiccanti o sotto N2 o gas Ar a -20 °C a -80 °C. La mancanza di segnale di acilazione o di segnale debole può essere dovuta a reagenti instabili, in particolare a vecchie soluzioni stock tbTA e azide. Inoltre, bisogna fare attenzione con le soluzioni stock di azide fluorescenti, che devono essere protette dalla luce il più possibile. Inoltre, potrebbe essere necessario testare variabili come il metodo di privazione lipidica e il tempo di etichettatura per determinare le condizioni ottimali a seconda del tipo di cellula utilizzata. Ad esempio, le cellule neuronali potrebbero aver bisogno di tempi di etichettatura più lunghi perché i cambiamenti dei media e la privazione lipidica sono difficili (non pubblicati).

Il vantaggio di questo protocollo è più drammatico se utilizzato per gli acidi grassi a catena più lunga. Per le catene più corte, l’aumento dell’intensità del segnale diventa meno drammatico, ma è comunque probabilmente protettivo per le cellule. Mentre le modifiche suggerite miglioreranno il rilevamento dell’acilazione proteica in generale, la chimica dei clic è ancora considerata un metodo lipidico-centrico1 che è limitato al rilevamento di proteine dinamiche, non stabilmente S-acilate1. Altre limitazioni da considerare includono il requisito della privazione di acidi grassi per promuovere l’etichettatura e la sua gamma relativamente limitata di tipi di cellule compatibili rispetto al rilevamento dello scambio acil-biotina (ABE) della S-acilazione16. Nonostante queste limitazioni, il rilevamento della chimica dei clic è più rapido della maggior parte dei saggi a scambio acilico ed è più adatto per il rilevamento di proteine che non tollerano le ripetute fasi di precipitazione proteica richieste per i saggi a scambio acile. Inoltre, questo approccio può essere combinato con l’etichettatura simultanea utilizzando altri saggi di clic come l’analisi pulse-chase38.

L’uso di questa modifica per l’etichettatura metabolica per la chimica dei clic ha aumentato il rilevamento complessivo delle proteine acilate, in particolare S-acilate, con una varietà di tecniche proteomiche che vengono utilizzate in combinazione con la chimica del clic. Come mostrato, il rilevamento fluorogenico può essere utilizzato come alternativa alla biotina (Figura 1)28. Ciò è particolarmente utile perché non ci sono proteine endogenamente fluorescenti nei lisati cellulari. Inoltre, è possibile utilizzare fluorofori attivati solo dopo la chimica dei clic46. L’acido grasso saponificato e legato a FAFBSA per l’etichettatura chimica dei clic può aiutare con difficoltà a rilevare le proteine di interesse a causa di un aumento complessivo della quantità di etichette disponibili nella cellula e limitando gli effetti tossici dell’aggiunta di acidi grassi direttamente al mezzo. Può anche essere utilizzato in combinazione con la spettrometria di massa27 per aumentare il rilevamento di proteine a bassa abbondanza, soprattutto se assunto insieme al recente progresso utilizzando algoritmi di apprendimento automatico che impediscono misurazioni ridondanti per aumentare la sensibilità alle proteine a bassa abbondanza, al contrario dell’acquisizione dipendente dai dati esistente che favorisce il rilevamento delle proteine più abbondanti47 . Inoltre, la chimica dei clic può essere combinata con l’etichettatura isotopica stabile con gli amminoacidi in coltura cellulare (SILAC) e i metodi di inseguimento a impulsi per produrre dati quantificabili sulla proteina dinamica S-acylation27. Infine, il gruppo Hannoush ha combinato la chimica del clic con il test di legatura di prossimità (PLA) per consentire la visualizzazione di singole cellule e gli esami nella distribuzione subcellulare di proteine palmitoilate43,48.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dal National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao è stata finanziata da The Ram and Lekha Tumkur Memorial Scholarship attraverso il Dipartimento di Biologia dell’Università di Waterloo e dalla Lucy Morrison Memorial Bursary attraverso IODE Ontario, oltre al finanziamento della ricerca universitaria dell’Università di Waterloo che comprende il Graduate Research Studentship (50503-11072), il Science Graduate Award e il Graduate Teaching Assistantship. Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Martin per il loro supporto nella preparazione di questo manoscritto, in particolare Stephanie Ryall, Harleen Gill e Sadia Khan che hanno contribuito inizialmente a creare il Martin Lab in preparazione di questi studi. Gli autori vorrebbero anche ringraziare il Dr. Luc Berthiaume per il gentile dono dei costrutti ctHTT-GFP e il Dr. Shaun Sanders per l’input critico nella preparazione del manoscritto. La Figura 3 è stata creata con BioRender.com.

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) Click Chemistry Tools 1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) Click Chemistry Tools 1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) Cayman Chemical Company 90270
30% acrylamide/bis solution 29:1 Biorad 1610156
96-well plate reader Biorad N/A
AFDye 647 azide plus Click Chemistry Tools 1482
Ammonium persulfate (APS) Biorad 1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine Biorad 12004167
Anti-rabbit Alexa 488 Invitrogen A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad 12004166
Biotin Azide Click Chemistry Tools 1265
Bis-tris, ultrapure VWR 715
Calcium chloride J.T. Baker 1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C Thermo Scientific N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) Life Technologies A3382101
ChemiDoc Imager Biorad N/A
Copper sulfate (1 mM) VWR BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate MP Biomedicals 102906
Detergent compatible (DC) assay Biorad N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO) VWR 0231-500 mL
DMEM, 1x Wisent Inc 319015CL
Ethanol, anhydrous N/A N/A
Fatty Acid Free BSA MP Biomedicals 219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer Biorad N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid VWR 5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 VWR N/A
Igepal CA-630 Alfa Aesar J61055
Image Lab Software Biorad N/A
L-glutamine supplement solution Wisent Inc 609-065-EL
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214-500
Methanol VWR BDH1135
Myristic Acid (25 mM) VWR M0476-25G
Palmitic acid (100 mM) VWR P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x Wisent Inc 450201EL
Pepstatin A (synthetic) Enzo Life Sciences ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride Enzo Life Sciences ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 VWR 75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) Eusera EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane Pall Life Sciences BSP0161
Potassium hydroxide Ward's Science 470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP Eusera EU1
Sodium chloride VWR 0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Sodium pyruvate Wisent Inc 600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate Thermo Fisher Scientific S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) Click Chemistry Tools 1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) Soltec Ventures M115
Tris Base Fisher Scientific BP152-5
Trypsin/EDTA Wisent Inc 325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L VWR 97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL VWR 89085-424
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References

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Liao, L. M. Q., Gray, R. A. V., Martin, D. D. O. Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (170), e62107, doi:10.3791/62107 (2021).
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