Applicazione del sistema RatWalker per l'analisi dell'andatura in un modello genetico di ratto della malattia di Parkinson

La PD, la più comune malattia neurodegenerativa del movimento legata all’età, è causata dalla perdita di neuroni DA nella substantia nigra pars compacta. Questa perdita di neuroni DA nigrali e gli input di DA nello striato portano alle compromissioni osservate della funzione motoria osservate nei pazienti con PD ^1,2. Le caratteristiche motorie che definiscono i pazienti con PD, note collettivamente come parkinsonismo, includono rigidità, tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e micrografia³. Inoltre, i disturbi dell’andatura, che sono comuni nei pazienti con PD, compaiono precocemente nel corso della malattia ^1,4,5. Mentre alcuni stili di vita sono suggeriti per aiutare a rallentare la progressione del PD, come un’alimentazione sana e un regolare esercizio fisico, attualmente non esiste una cura per il PD, solo farmaci per gestire i sintomi. Ciò lascia spazio alla necessità di ulteriori indagini nella speranza di migliorare le terapie. Pertanto, la caratterizzazione del modello di andatura nei modelli animali di PD è uno strumento cruciale per caratterizzare la rilevanza del modello e il modo in cui i trattamenti terapeutici volti a controllare il PD stanno prevenendo o migliorando le menomazioni motorie.

Ci sono vari modelli animali PD che sono stati utilizzati per testare trattamenti terapeutici, tuttavia ognuno ha i suoi limiti. Ad esempio, modelli animali trattati con la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui processi importanti per la perdita dei neuroni DA nigrale e i successivi adattamenti striatali, e hanno indicato il ruolo dei mitocondri nella patogenesi della PD; tuttavia, il background patogenetico del modello MPTP è di natura tossica piuttosto che un processo neurodegenerativo come nel PD 6^umano. Ulteriori modelli chimicamente inducibili includono 6-idrossidopamina (6-OHDA) e rotenone. 6-OHDA è stato il primo agente utilizzato per indurre PD mediante accumulo selettivo del farmaco nei neuroni DA, che alla fine uccide i neuroni e porta a sintomi simili a PD. Questo modello è stato utilizzato per la prima volta per il monitoraggio della deplezione di DA esaminando il comportamento in risposta all’anfetamina e all’apomorfina⁷. Questo metodo di induzione del PD si è dimostrato utile per lo screening di agenti farmacologici che hanno un impatto su DA e sui suoi recettori⁸. Mentre il modello 6-OHDA è un ottimo modello per tracciare i deficit motori quantificabili, questo modello non mostra come la graduale perdita di neuroni e la formazione di corpi di Lewy influiscano sull’animale. L’altro metodo di induzione, il rotenone, ha dimostrato di avere una progressiva degenerazione dei neuroni nigrostriatali con la perdita di tirosina idrossilasi e trasportatore DA, consentendo un modello migliore per tracciare la perdita di neuroni nel tempo⁹. I ratti trattati con rotenone hanno mostrato bradicinesia, instabilità posturale e andatura instabile¹⁰. Tuttavia, questo metodo è risultato essere ampiamente variabile tra diversi ceppi di ratti, il che ha provocato dubbi sul fatto che il rotenone sia o meno un modello PD affidabile^11,12,13. Mentre l’analisi dell’andatura ha dimostrato di essere influenzata dall’induzione del PD nei ratti, fino ad oggi, i modelli di ratto PD geneticamente indotti non sono stati prontamente utilizzati per l’analisi dell’andatura camminando liberamente lungo una pista.

Un modo per analizzare la compromissione motoria nei roditori che camminano liberamente è l’analisi cinematica dell’andatura, che può essere eseguita utilizzando l’imaging FTIR. Questo metodo consolidato utilizza un sensore tattile ottico basato su FTIR, che registra e traccia le impronte dei roditori mentre si muovono lungo la pista^14,15,16. Rispetto ad altri metodi, FTIR non dipende da alcun marcatore sul corpo dell’animale che potrebbe interferire con le impronte delle zampe. La generazione dei dati video produce impronte digitali di zampe di tutti e quattro gli arti che possono essere combinate per creare un modello di camminata dinamico e riproducibile per vari modelli di roditori. Il principio dell’analisi dell’andatura basata sull’imaging è quello di prendere ogni singola zampa e misurare l’area di contatto nel tempo mentre il roditore cammina lungo la pista. Ogni posizione è rappresentata da un aumento dell’area della zampa (nella fase di frenata) e una diminuzione dell’area della zampa (nella fase di propulsione). Questo è proceduto dalla fase di oscillazione, che è quando non viene rilevato alcun segnale di zampa. Dopo la valutazione del video, vengono generati diversi parametri che possono essere utilizzati per confrontare il modello wild-type (WT) rispetto al modello PD. Alcuni esempi di parametri sono la lunghezza del passo (distanza che la zampa copre in un passo), la durata dell’oscillazione (durata del tempo in cui la zampa non è in contatto con la pista), la velocità di oscillazione (lunghezza del passo in funzione della durata dell’oscillazione) e il modello di passo (passi diagonali, gradini laterali o gradini della cintura).

Per dimostrare l’utilità della FTIR per scoprire i primi cambiamenti del modello di andatura nei ratti, abbiamo usato un modello genetico di ratto di PD. Mentre la maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; l’identificazione di forme ereditarie di mutazioni e varianti genetiche scoperte per il PD, come le mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale¹⁷, che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali¹⁸. Sfortunatamente, i topi sono resistenti alla neurodegenerazione per perdita di queste proteine (singole e combinate)19,20,21. Nei ratti, il Pink1 ma non il deficit di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e a menomazioni motorie²², ma senza penetranza completa. Pertanto, abbiamo generato un modello combinato di ratto Pink1 / Parkin double knockout (DKO), che mostra il fenotipo di trascinamento degli arti posteriori visivamente evidente riportato nei ratti maschi Pink1 KO²², ma ora a un tasso più elevato: 100% contro 30-50% dei maschi tra 4-6 mesi.

Mentre questo metodo funziona bene per analizzare i deficit motori nei topi¹⁴, le specifiche del sistema di andatura di imaging FTIR per adattarsi alle dimensioni e al peso dei ratti non erano precedentemente disponibili non commerciali. Qui spieghiamo come costruire il RatWalker, un sistema di imaging dell’andatura FTIR modificato modellato sul MouseWalker¹⁴, tranne adattato per le dimensioni e il peso dei ratti. Questo sistema utilizza un effetto ottico, FTIR, per fornire un metodo per visualizzare e successivamente registrare le impronte degli animali per l’analisi. Il contatto del piede di un animale con la guida d’onda ottica (piattaforma) provoca interruzioni nel percorso della luce con conseguente effetto di dispersione visibile, che viene catturato utilizzando videografia domestica ad alta velocità ed elaborazione utilizzando software open source. Questo studio dimostra il potere dell’imaging FTIR nello studio dei cambiamenti dell’andatura nei modelli genetici di ratto di PD. Ad esempio, mentre i cambiamenti motori palesi visivamente evidenti (cioè il trascinamento degli arti posteriori) sono osservati nei ratti DKO maschi al più presto a 4 mesi, utilizzando FTIR siamo in grado di scoprire anomalie del gate nei ratti DKO maschi a 2 mesi di età.