Här presenterar vi en effektiv och effektiv metod för gnagare svans ven injektioner med hjälp av en unikt utformad uppvärmning / fasthållningsanordning. Genom att effektivisera initieringen av vasodilatation och fasthållningsprocesser tillåter detta protokoll exakta och i rätt tid intravenösa injektioner av stora grupper av djur med minimal nöd.
I gnagarmodeller är svansveninjektioner viktiga metoder för intravenös administrering av experimentella medel. Svansveninjektioner innebär vanligtvis uppvärmning av djuret för att främja vasodilatation, vilket hjälper till att både identifiera blodkärlen och placera nålen i kärllummen samtidigt som djuret hålls fast ordentligt. Även om svans ven injektioner är vanliga förfaranden i många protokoll och anses inte vara mycket tekniska om utförs korrekt, exakta och konsekventa injektioner är avgörande för att erhålla reproducerbara resultat och minimera variabilitet. Konventionella metoder för att inducera vasodilatation före svansveninjektioner beror i allmänhet på användningen av en värmekälla som värmelampa, elektriska/uppladdningsbara värmedynor eller förvärmt vatten vid 37 °C. Trots att dessa verktyg är lättillgängliga i en standardlaboratoriumsinställning lider de uppenbarligen av dålig/begränsad termoreglerande kapacitet. På samma sätt, även om olika former av fasthållningsanordningar är kommersiellt tillgängliga, måste de användas noggrant för att undvika trauma för djuren. Dessa begränsningar av de nuvarande metoderna skapar onödiga variabler i experiment eller resulterar i varierande resultat mellan experiment och/eller laboratorier.
I den här artikeln demonstrerar vi ett förbättrat protokoll med hjälp av en innovativ enhet som kombinerar en oberoende, termiskt reglerad, värmande enhet med en justerbar fasthållningsenhet i ett system för effektiv strömlinjeformad svansveinjektion. Exemplet vi använder är en intravenös modell av svamp blodomlopp infektion som resulterar i sepsis. Uppvärmningsapparaten består av en värmereflekterad akryllåda installerad med en justerbar automatisk termostat för att bibehålla den inre temperaturen vid en förinställningströskel. På samma sätt kan bredden och höjden på konhållarapparaten justeras för att säkert rymma olika gnagarestorlekar. Med enhetens avancerade och mångsidiga egenskaper kan tekniken som visas här bli ett användbart verktyg inom en rad forskningsområden som involverar gnagaremodeller som använder svansveinjektioner.
Användningen av djurmodeller som involverar gnagare har varit en stapelvara i biomedicinsk forskning. Många inavlade och utraslade stammar, liksom genetiskt modifierade linjer, finns tillgängliga och används rutinmässigt i laboratorier över hela världen. Svansveninjektion är en av de viktigaste metoderna i gnagaremodeller som kräver intravenös (dvs. administrering av experimentella medel). I allmänhet har injektioner stora fördelar jämfört med andra administreringsvägar, såsom höga absorbanshastigheter genom att kringgå lokala vävnader och mag-tarmkanalen och hög tolerans mot lösningar av ett brett spektrum av koncentrationer eller icke-fysiologiska pH1,2,3,4. Bland andra livskraftiga i.v. rutter (t.ex. saphenous vener, retro-orbital venous sinus), anses svansvener vara det säkraste och mest lättillgängliga blodkärlet hos gnagare2,3,5,6. Därför har svans veninjektion använts i stor utsträckning i en rad gnagaremodeller inklusive infektionssjukdomarmodeller 7,8,9,transplantation av biologiska material10,11,utvärdering av prekliniska terapier12,13, och toxikologiska analyser14,15.
Konsistens och noggrannhet i dosering är ett kritiskt krav vid framgångsrika svansvesinjektioner. Överraskande, kvantitativ och kvalitativ utvärdering av svans ven injektioner i litteraturen innebär frekventa felinjektioner16,17. En studie rapporterade att tolv av trettio injektioner utförda av utbildade injektorer lämnade mer än 10% av injicerade doser i svansen18. Dessutom bör säkerheten och komforten hos det djur som får svansvesinjektioner vara ett primärt problem under proceduren. Felaktig återhållsamhet kan leda till skador och en rad stressrelaterade patologier (t.ex. viktminskning, nedsatt immunsvar) som kan införa betydande variabler i provkvalitet19,20. Dessa fel kan orsaka ökad variation i data och dålig reproducerbarhet, vilket påverkar studieresultaten negativt.
Induktion av vaskulär dilatation hos djuret är ofta nödvändigt vid utförande svansvevinjektioner på grund av kärlets lilla diameter, uppskattad till 300 μm hos möss21. Vasodilatation förbättrar synligheten av svansvener och hjälper till att uppnå optimal nål-venin justering inom venous lumen. En mängd olika metoder har rapporterats av laboratorier som att doppa svansen i varmtvatten 22, applicera värme på svansen med ett varmt draperi, lampa eller hårtork23,24, eller placera djuret i en varm miljö med en värmeplatta, inkubator eller låda i kombination med en av dessa värmekällor25. Enheterna kan antingen vara självtillverkade för specifika ändamål eller tillgängliga från kommersiella leverantörer. Många saknar dock termoregulatorisk kapacitet och om någon är enhetens temperatur dåligt underhållen och utsätts ofta för variationer i rumstemperaturen. På samma sätt är användningen av en fasthållningsanordning nödvändig för svansvesinjektioner eftersom användningen av anestesi inte rekommenderas26,27. Flera typer av laboratoriespecifika eller kommersiella fasthållningsanordningar har utvecklats. Vanligtvis placeras djuret i ett engångsrör på 50 mlkoniskt rör 4, slitsade plexiglasväggar, en tunnel eller kon28, som alla tillåter riklig exponering av svansen samtidigt som djurets rörelser begränsars. De flesta återhållsamma har dock storleksbegränsningar på grund av materialens styvhet. Dessutom verkar moderna högkomplexa anordningar, trots de praktiska och sofistikerade designerna, inte vara genomförbara för injektioner som involverar stora grupper av djur22.
Musmodeller av blodomloppsinfektion och tillhörande sepsis är ett utmärkt exempel på situationer som kräver användning av denna teknik. Bland alla mikrobiella etiologi av allvarliga kliniska sepsis, svamp sepsis är ofta ett dödligt tillstånd med dödlighet på >40% trots svampdödande terapi29. Faktum är att infektion av Candida albicans har rapporterats som den fjärde ledande orsaken till sjukhusförvärvad blodomloppsinfektion (candidemia)30,31. Vid candidiasis inom buken kan mikroorganismer i mag-tarmkanalen spridas via blodomloppet och orsaka polymikrobiell sepsis med en ännu störredödlighet 32,33,34. Som de flesta nosokomial candidemia fall framträder från förorenade centrala linjen katetrar eller indwelling medicintekniskaprodukter 35,36, dvs inympning med C. albicans genom svans ven injektion kan nära spegla mänsklig sepsis utveckling och har varit en häftklammer metod i en mus modell av hematogenly spridas candidiasis37,38. I denna modell kan dödligheten som inträffar i dagar förlängas eller förkortas genom att justera C. albicans i.v. inokulat39,40,41.
Nyligen har vårt laboratorium utvecklat ett innovativt protokoll för en optimalt strömlinjeformad svansvenadsinjektion med hjälp av en innovativ enhet utrustad med en termoreglerad uppvärmningsenhet, i kombination med en justerbar fasthållningsenhet, i ett bekvämt system. Detta protokoll gör det möjligt för forskare att utföra svansvektioner på ett korrekt och i rätt tid, medan djur kan konditioneras säkert och hållas fast för proceduren med minimal nöd. De tekniker som demonstreras här, med hjälp av den avancerade uppvärmnings- och fasthållningsanordningen, skulle kunna fungera som ett användbart verktyg inom olika forskningsområden som använder gnagaremodeller.
Konsekvent och exakt dosering är nyckelkrav för experimentell tillförlitlighet i djurmodeller. Detta är särskilt viktigt vid i.v. administrering där systemisk biotillgänglighet av injicerade medel är betydligt högre/snabbare än med andra administreringsvägar3. Således kan fel i svansveininjektion ha en skadlig inverkan på studieresultaten. Historiskt sett har intraperitoneal (dvs. injektion), snarare än i.v., varit den vanligaste metoden för systemisk åtkomst hos gnagare på grund av teknisk enkelhet och bekvämlighet. Administreringsvägar blir dock mer avgörande när man översätter prekliniska avläsningar från djur till kliniska miljöer. Därför finns det ett behov av kontinuerlig förbättring av gnagareprotokoll som kan underlätta framgångsrik svansveinjektion.
Den viktigaste utvecklingen i det nuvarande protokollet är den innovativa termoreglerade uppvärmningsanordningen som möjliggör effektiv induktion av vasodilatation hos gnagare, vilket dramatiskt förbättrar synligheten för svansvener och nåljustering. Uppvärmningsmetoder som är dåligt termoreglerade (t.ex. lampor), tokiska vasodilatatorer eller hudirriterande ämnen (t.ex. xylener) är inte bara opålitliga, utan är också osäkra för djuret och börundvikas 44. I motsats till andra konventionella metoder, såsom att fördjupa svansen i varmt vatten, kan autoregleringsförmågan hos denna enhet säkert konditionera flera djur samtidigt. Dessutom förstärks detta protokoll ytterligare genom att använda den optimalt utformade fasthållningsanordningen och möjliggöra snabb och säker immobilisering av djuret i ett läge som bäst visar den laterala svans venen.
De transparenta tubalformaten som ses i många nuvarande fasthållningshållare, även om de är praktiskt väl utformade, kräver mer hanteringstid med varje djur, vilket förlänger fasthållningsprocessen45. Detta kan vara mer problematiskt hos gnagarestammar med aggressiva egenskaper som erbjuder begränsat samarbete46,47. Däremot tillåter fasthållningsanordningens halvslutna konstruktur snabb positionering av djuret och hjälper till att minimera fasthållningstiden. Tillsammans påskyndar det strömlinjeformade protokollet med hjälp av det innovativa, mycket optimerade uppvärmnings-/återhållsamhetssystemet injektionsproceduren, vilket möjliggör snabb och effektiv dosering av stora grupper av djur. I vårt laboratorium slutför vi vanligtvis en hel injektionsprocedur på 30 möss från värmebehandling till övervakning efter injektion inom 1 timme med detta protokoll.
Trots de avancerade funktionerna har denna enhet några uppenbara nackdelar: den första är kostnaden för enheten och rutinmässigt utbyte av glödlampa i uppvärmningskammaren. Förutom injektionernas effektivitet och hastighet är dock enheten hållbar för upprepad användning och kompatibel med de vanligaste desinfektionsmedel, vilket möjliggör noggrann rengöring av enheten mellan användningarna. Tillsammans kompenserar detta den ursprungliga investeringen. Isituationer med begränsad arbetsyta kan en nackdel med detta protokoll vara kravet på en dedikerad bänkyta som är tillräckligt stor för att placera de två enheterna, sida vid sida, medan injektionen utförs. Men eftersom enheten kan användas brett över flera gnagareprotokoll som involverar i.v. injektioner, är det möjligt att enheten kan fungera som ett kärninstrument som liknar annan gemensam vivariumutrustning som isofluranförångare. Oavsett är de två enheterna lätt bärbara och kan buntas och stuvas undan utan användning.
Den i.v. dödliga utmaningsmodellen av murin svamp sepsis beskrivs i detta protokoll efterliknar nära C. albicans blodomlopp infektioner hos människor och har använts i stor utsträckning för att studera svamp virulens, testa effekten av svampdödande terapier och karakterisera värd immunsvar mot infektion37,39,48. För att uppnå en reproducerbar infektion är inokulering via svansvevinjektion det viktigaste steget i protokollet för att säkerställa korrekt leverans av organismerna i blodomloppet. Faktum är att djur reagerar mycket olika på olika nivåer av Candida, dvs. utmaningar; administrering av för låga mängder inokulat kommer att leda till oönskade spontana återhämtningar, medan djur som får för höga doser kommer att duka under i förtid. Det specifika fönstret av inokulatstorlekar för en given organism för att inducera en konsekvent nivå av sepsis/dödlighet beror till stor del på både svampstammar och musstammar.
Det nuvarande protokollet med schweiziska Webster möss vid inokulat av 1 x 105 vilda typ C. albicans reproducibly inducerad uppkomsten av sepsis sjuklighet inom 1 dag, följt av progressiv dödlighet som resulterar i 100% dödlighet med 5-7 dagar. Däremot leder inokula högre än 1 x 105 vanligtvis till accelererade dödsfall (dvs. 1-2 dagar vid 1 x 106, 3-4 dagar vid 5 x 105), och de som är lägre än 1 x 105 är subletala. I linje med många rapporter i litteraturen resulterar användningen avicke-albicans Candida arter i stället för C. albicans i avsevärt minskad dödlighet40,49. Dessutom kan valet av musstammar, eller till och med koloniernas ursprung, ha en betydande inverkan på infektionsutfall på grund av varierande känslighet mellan musstammar, som rapporterats avandra 39,40,41,50,51,52,53,54,55. Därför bör båda beaktas vid utformningen av experiment.
Efter en dödlig i.v. utmaning sprider sig svampceller snabbt genom blodomloppet och börjar invadera flera organ, bland vilka de mest drabbade är njurarna41. Andra organ som påverkas är hjärnan, mjälten och benmärgen48,56. Oavsett, akut sepsis är den ultimata dödsorsaken i tidig tid punkterna37. Som visas i de representativa resultaten kan sepsis svårighetsgrad kvantitativt bedömas av Mus klinisk bedömning poäng för sepsis (M-CASS) baserat på uppvisade tecken på ett sepsis villkor i utmanade djur43,57. Bland de flera surrogatmarkörerna för dödlig sepsis har hypotermi föreslagits som en kritisk prediktor för överhängande död i både klinisk och experimentell sepsis43,58,59.
Även om inga formella studier har utförts för att direkt jämföra inavlade jämfört med utraslade möss i denna modell, är data som erhållits från det nuvarande protokollet med hjälp av outbred schweiziska Webster möss exceptionellt reproducerbara i olika sepsisparametrar, trots den förmodade genetiska heterogeniteten. I allmänhet är ett mönster av dödlighet som faller inom 3-5 dagar en fast modell av akut sepsis, vilket framgår av snabb ökning av sepsis sjuklighet och nivåer av inflammatoriska markörer inom timmar efter post-lethal utmaning50,51. Under längre överlevnadstider (7–10 dagar) är dödligheten sannolikt resultatet av mikrobiell börda som leder till dödliga vävnadsskador i målorganen och centrala nervsystemet. Valet av sepsis eller mikrobiell börda kan vid behov tillämpas för att utvärdera immunfunktioner eller svar på antiinflammatoriska regimer eller svampdödande behandlingar/vacciner, som bestäms av det inokulat som används.
Förutom den i.v. dödliga utmaningsmodellen kan intra-abdominal infektion med C. albicans hos möss via en i.p. utmaning också leda till spridad candidiasis och efterföljande sepsis, även om ko-inympning med bakteriella patogenen, Staphylococcus aureus, synergistiskt ökar dödligheten jämfört med C. albicans monoinfektion51,60,61. I den i.p. dödliga utmaningsmodellen krävs betydligt högre mikrobiell inokula (1,75 x 107C. albicaner/8 x 107S. aureus per mus) för att orsaka polymikrobiell peritonit och spridning av organismerna från bukhålan i blodomloppet. På samma sätt leder gastrointestinal infektion med C. albicans hos möss som behandlats med immunsuppressiva och/eller slemhinnor till flyttning av svampcellerna till blodomloppet och resulterar i svamp sepsis62,63. Trots de distinkta inokuleringsvägarna är mekanismen för efterföljande svamp sepsis till stor del analog mellan de tre sjukdomsmodellerna, vilket innebär ett okontrollerat systemiskt proinflammatoriskt svar på Candida som leder till organsvikt37,51,61. På samma sätt, hos människor, är det denna process av värdsvaret, inte bara candidemia, som orsakar den höga sjuklighet / dödlighet i samband med hematogent spridd candidiasis förvärvad i hälso- ochsjukvårdsinställningar 64,65.
Med hjälp av den nuvarande svamp sepsis modellen visar vi här att skydd mot dödliga C. albicans infektion kan uppnås genom i.v. pre-immunization/vaccination med C. dubliniensis (avirulent) eller försvagade C. albicans mutanter, samtidig med betydande minskning av sepsis sjuklighet. Skyddet förmedlas av medfödda Gr-1+ myeloisk-härledda suppressorceller som verkar induceras i benmärgen som en form av utbildad medfödd immunitet66,67. Ansträngningar pågår för att utöka förståelsen av denna nya form av medfödda immunmedmerade skydd mot C. albicans blodomloppsinfektioner.
Sammanfattningsvis har den innovativa gnagareuppvärmnings-/fasthållningsanordningen bidragit till att främja vår förmåga att utföra i.v. injektioner av storskaliga flergruppsdjurstudier på ett effektivt och ändamålsenligt sätt. Som sådan har vi myntat termen, Mus en minut, för enheten. Enhetsspecifikationerna är tillgängliga från motsvarande författare på begäran för upphandling av en liknande enhet. De tekniker som demonstreras här kan fungera som ett användbart verktyg i gnagaremodeller som använder svansveinjektioner inom ett brett spektrum av forskningsområden.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av LSUHSC Foundation (PLF), och delvis av U54 GM104940 från National Institute of General Medical Sciences vid National Institutes of Health, som finansierar Louisiana Clinical and Translational Science Center.
Candida albicans strain DAY185 | Carnegie Melon University | N/A | provided by the laboratory of Aaron Mitchell |
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ | University of Tennessee Health Sciences Center | N/A | provided by the laboratory of Glen Palmer |
Candida dubliniensis strain Wü284 | Trinity College, Dublin, Ireland | N/A | provided by the laboratory of Gary Moran |
Mice | Charles River Laboratories | 551NCICr:SW | Female Swiss Webster; 6-8 weeks old |
Mice | Charles River Laboratories | 556NCIC57BL/6 | Female C57BL/6; 6-8 weeks old |
Needles, 27G, ½-in | Becton Dickinson | 305109 | can be substituted from other vendors |
Phosphate buffered saline (PBS) | GE | SH30028.02 | can be substituted from other vendors |
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) | LSU Health | custom order | Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health |
Sabouraud dextrose agar (SDA) | Becton Dickinson | 211584 | can be substituted from other vendors |
Syringes, 1 mL | Becton Dickinson | 309659 | can be substituted from other vendors |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Yeast peptone dextrose (YPD) broth | Fisher Scientific | BP2469 | can be substituted from other vendors |