Her presenterer vi en effektiv og effektiv metode for gnagerhale vene injeksjoner ved hjelp av en unikt designet oppvarming / restraining enhet. Ved å effektivisere initiering av vasodilerings- og besøksforbudsprosesser, tillater denne protokollen nøyaktige og rettidig intravenøse injeksjoner av store grupper av dyr med minimal nød.
I gnagermodeller er hale vene injeksjoner viktige metoder for intravenøs administrering av eksperimentelle midler. Hale vene injeksjoner innebærer vanligvis oppvarming av dyret for å fremme vasodilatasjon, som hjelper i både identifisering av blodårene og posisjonering av nålen i fartøyet lumen mens sikkert begrense dyret. Selv om hale vene injeksjoner er vanlige prosedyrer i mange protokoller og anses ikke svært teknisk hvis de utføres riktig, nøyaktige og konsekvente injeksjoner er avgjørende for å oppnå reproduserbare resultater og minimere variasjon. Konvensjonelle metoder for å indusere vasodilatasjon før hale vene injeksjoner generelt avhenge av bruk av en varmekilde som en varmelampe, elektriske / oppladbare varmeputer, eller forvarmet vann ved 37 °C. Til tross for at de er lett tilgjengelige i en standard laboratorieinnstilling, lider disse verktøyene tydeligvis av dårlig / begrenset termoregulerende kapasitet. På samme måte, selv om ulike former for begrensningsanordninger er kommersielt tilgjengelige, må de brukes nøye for å unngå traumer for dyrene. Disse begrensningene i dagens metoder skaper unødvendige variabler i eksperimenter eller resulterer i varierende resultater mellom eksperimenter og /eller laboratorier.
I denne artikkelen demonstrerer vi en forbedret protokoll ved hjelp av en innovativ enhet som kombinerer en uavhengig, termisk regulert oppvarmingsenhet med en justerbar begrensningsenhet i ett system for effektiv strømlinjeformet hale veneinjeksjon. Eksemplet vi bruker er en intravenøs modell av soppblodstrøminfeksjon som resulterer i sepsis. Varmeapparatet består av en varmereflekterende akrylboks installert med en justerbar automatisk termostat for å opprettholde den interne temperaturen ved en forhåndsinnstilt terskel. På samme måte kan bredden og høyden på kjeglebeherskelsesapparatet justeres for å trygt imøtekomme ulike gnagerstørrelser. Med de avanserte og allsidige egenskapene til enheten, kan teknikken som vises her bli et nyttig verktøy på tvers av en rekke forskningsområder som involverer gnagermodeller som bruker hale veneinjeksjoner.
Bruken av dyremodeller som involverer gnagere har vært en stift av biomedisinsk forskning. Tallrike innavls- og utraslede stammer, samt genetisk modifiserte linjer, er tilgjengelige og brukes rutinemessig i laboratorier over hele verden. Hale vene injeksjon er en av de essensielle metodene i gnager modeller som krever intravenøs (i.v.) administrasjon av eksperimentelle midler. Generelt har i.v. injeksjoner store fordeler i forhold til andre administrasjonsruter som høye absorbansrater ved å omgå lokalt vev og fordøyelseskanalen og høy toleranse for løsninger av et bredt spekter av konsentrasjoner eller ikke-fysiologisk pH1,2,3,4. Blant andre levedyktige i.v. ruter (f.eks. saphenous årer, retro-orbital venøs sinus), hale årer regnes som den sikreste og lettest tilgjengelige blodkar i gnagere2,3,5,6. Derfor har hale veneinjeksjon vært mye brukt i en rekke gnagermodeller, inkludert smittsomme sykdomsmodeller7,8,9, transplantasjon av biologiske materialer10,11, evaluering av prekliniske terapeutiske12,13og toksikologiske analyser14,15.
Konsistens og nøyaktighet av dosering er et kritisk krav i vellykkede hale vene injeksjoner. Overraskende, kvantitativ og kvalitativ evaluering av hale vene injeksjoner i litteraturen impliserer hyppige feilinjeksjoner16,17. En studie rapporterte at tolv av tretti injeksjoner utført av trente injektorer etterlot mer enn 10% av injiserte doser i halen18. I tillegg bør sikkerheten og komforten til dyret som mottar hale vene injeksjoner være en primær bekymring under prosedyren. Feil selvbeherskelse kan føre til skader og en rekke stressrelaterte patologier (f.eks. vekttap, nedsatt immunrespons) som kan introdusere betydelige variabler i prøvekvalitet19,20. Disse feilene kan føre til økt variasjon i data og dårlig reproduserbarhet, og dermed påvirke studieresultatene negativt.
Induksjon av vaskulær dilatasjon i dyret er ofte nødvendig når du utfører hale vene injeksjoner på grunn av den lille diameteren på fartøyet, anslått til å være 300 μm hos mus21. Vasodilatasjon forbedrer synligheten av hale årer og hjelpemidler i å oppnå optimal nål-vene justering i venøse lumen. En rekke metoder har blitt rapportert av laboratorier som å nedsenke halen i varmt vann22, bruke varme på halen ved hjelp av en varm gardin, lampe eller hårføner23,24, eller plassere dyret i et varmt miljø ved hjelp av en varmepute, inkubator eller boks kombinert med en av disse varmekildene25. Enhetene kan enten være selvlagde for spesifikke formål eller tilgjengelig fra kommersielle leverandører. Imidlertid mangler mange termoregulatoriske evner, og hvis noen, er enhetstemperaturen dårlig vedlikeholdt og ofte gjenstand for variasjoner i romtemperatur. På samme måte er bruk av en begrensende enhet nødvendig for hale vene injeksjoner som bruk av anestesi anbefales ikke26,27. Flere typer laboratoriespesifikke eller kommersielle holdemidler er utviklet. Vanligvis er dyret plassert i et engangs 50 ml konisk rør4, slotted plexiglassvegger, en tunnel eller kjegle28, som alle tillater rikelig eksponering av halen mens du begrenser dyrets bevegelser. Imidlertid har de fleste restrainers størrelsesbegrensninger på grunn av materialets stivhet. Videre ser moderne høykompleksitetsenheter, til tross for de praktiske og sofistikerte designene, ikke ut til å være mulig for injeksjoner som involverer store grupper av dyr22.
Musemodeller av blodstrømsinfeksjon og tilhørende sepsis er et godt eksempel på situasjoner som krever bruk av denne teknikken. Blant all mikrobiell etiologi av alvorlig klinisk sepsis er sopp sepsis ofte en dødelig tilstand med dødelighet på >40% til tross for antifungal terapi29. Faktisk har infeksjon av Candida albicans blitt rapportert som den fjerde ledende årsaken til sykehusoppkjøpt blodstrømsinfeksjon (candidemia)30,31. Ved intra-abdominal candidiasis kan mikroorganismer i mage-tarmkanalen spre seg via blodet og forårsake polymikrobiell sepsis med en enda større dødelighet32,33,34. Som de fleste nosocomial candidemia tilfeller kommer fra forurenset sentral linje katetre eller indwelling medisinsk utstyr35,36, i.v. inokulering med C. albicans ved hale vene injeksjon kan tett speile menneskelig sepsis utvikling og har vært en stift metode i en musemodell av hematogent spredd candidiasis37,38. I denne modellen kan dødelighet som oppstår i dager utvides eller forkortes ved å justere C. albicans i.v. inoculum39,40,41.
Nylig har laboratoriet vårt utviklet en innovativ protokoll for en optimalt strømlinjeformet hale vene injeksjon ved hjelp av en innovativ enhet utstyrt med en termoregulert oppvarming enhet, sammen med en justerbar restraining enhet, i ett praktisk system. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å utføre hale vene injeksjoner på en nøyaktig og rettidig måte, mens dyr kan være trygt betinget og begrenset for prosedyren med minimal nød. Teknikkene demonstrert her, med bruk av avansert oppvarming og tilbakeholdelsesanordning, kan tjene som et nyttig verktøy i ulike forskningsområder som bruker gnagermodeller.
Konsekvent og nøyaktig dosering er viktige krav til eksperimentell pålitelighet i dyremodeller. Dette er spesielt viktig i tilfeller av i.v. administrasjon der systemisk biotilgjengelighet av injiserte midler er betydelig høyere / raskere enn med andre administrasjonsruter3. Dermed kan feil i hale vene injeksjon ha en skadelig innvirkning på studieresultatene. Historisk har intraperitoneal (i.p.) injeksjon, i stedet for i.v., vært den vanligste metoden for systemisk tilgang hos gnagere på grunn av teknisk enkelhet og bekvemmelighet. Administrasjonsruter blir imidlertid mer avgjørende når man oversetter prekliniske avlesninger fra dyr til kliniske omgivelser. Derfor er det behov for kontinuerlig forbedring i gnagerprotokoller som kan lette vellykket hale vene injeksjon.
Det viktigste fremskrittet i den nåværende protokollen er den innovative termoregulerte oppvarmingsenheten som muliggjør effektiv induksjon av vasodilatasjon hos gnagere, noe som dramatisk forbedrer synligheten av hale årer og nåljustering. Oppvarmingsmetoder som er dårlig termoregulert (f.eks. lamper), aktuelle vasodilatorer eller hudirritanter (f.eks. xylener) er ikke bare upålitelige, men er også usikre for dyret og bør unngås44. I motsetning til andre konvensjonelle metoder, for eksempel å nedsenke halen i varmt vann, kan autoreguleringsevnen til denne enheten trygt kondisjonere flere dyr samtidig. I tillegg styrkes denne protokollen ytterligere ved å bruke den optimalt utformede begrensningsanordningen og tillate rask og sikker immobilisering av dyret i en posisjon som best viser sidehalevenen.
De gjennomsiktige rørformatene sett i mange nåværende restrainers, selv om de er praktisk talt godt designet, krever mer håndteringstid med hvert dyr, og forlenger dermed besøksforbudsprosessen45. Dette kan være mer problematisk i gnagerstammer med aggressive egenskaper som tilbyr begrenset samarbeid46,47. I motsetning tillater den semi-lukkede kjeglestrukturen til begrensningsanordningen rask posisjonering av dyret og hjelper til med å minimere varigheten av selvbeherskelse. Sammen akselererer den strømlinjeformede protokollen ved hjelp av det innovative, svært optimaliserte varme-/besøksforbudet injeksjonsprosedyren, noe som muliggjør rask og effektiv dosering av store dyregrupper. I vårt laboratorium fullfører vi vanligvis en hel injeksjonsprosedyre på 30 mus fra varmebehandling til overvåking etter injeksjon innen 1 time ved hjelp av denne protokollen.
Til tross for de avanserte funksjonene har denne enheten noen åpenbare ulemper: den første er kostnaden for enheten og rutinemessig lyspæreutskifting i varmekammeret. Men i tillegg til effektiviteten og hastigheten på injeksjoner, er enheten holdbar for gjentatt bruk og kompatibel med de fleste vanlige desinfeksjonsmidler, slik at grundig rengjøring av enheten mellom bruk. Sammen motposterer dette den opprinnelige investeringen. Second, i situasjoner med begrenset arbeidsområde, en ulempe med denne protokollen kan være kravet om et dedikert benkområde stort nok til å plassere de to enhetene, side om side, mens du utfører injeksjonen. Men fordi enheten kan brukes bredt på tvers av flere gnagerprotokoller som involverer i.v. injeksjoner, er det mulig at enheten kan fungere som et kjerneinstrument som ligner på annet felles vivariumutstyr som isofluran fordampere. Uansett er de to enhetene lett bærbare og kan leveres og stues mens de ikke er i bruk.
Den i.v. dødelige utfordringsmodellen av murin sopp sepsis beskrevet i denne protokollen etterligner C. albicans blodstrømsinfeksjoner hos mennesker og har blitt mye brukt til å studere soppvirvel, testeffekt av antifungale terapier og karakterisere vert immunresponser på infeksjon37,39,48. For å oppnå en reproduserbar infeksjon er inokulering via hale veneinjeksjon det viktigste trinnet i protokollen for å sikre nøyaktig levering av organismene i blodet. Faktisk reagerer dyr veldig annerledes på forskjellige nivåer av Candida i.v. utfordringer; administrering av for lave mengder inokulum vil resultere i uønskede spontane gjenopprettelser, mens dyr som får for høye doser vil bukke under for tidlig. Det spesifikke vinduet med inokulumstørrelser for en gitt organisme for å indusere et konsistent nivå av sepsis / dødelighet avhenger i stor grad av både soppstammer og musestammer.
Den nåværende protokollen ved hjelp av sveitsiske Webster mus ved inoculum av 1 x 105 wild-type C. albicans gjenfrodusert reprodusert utbruddet av sepsis morbiditet innen 1 dag, etterfulgt av progressiv dødelighet som resulterte i 100% dødelighet med 5-7 dager. Derimot fører inocula høyere enn 1 x 105 vanligvis til akselererte dødsfall (dvs. 1-2 dager ved 1 x 106, 3-4 dager ved 5 x 105), og de lavere enn 1 x 105 er sub-dødelige. I tråd med mange rapporter i litteraturen resulterer bruken avikke-albicans Candida-arter i stedet for C. albicans i betydelig redusert dødelighet40,49. I tillegg kan valget av musestammer, eller til og med opprinnelsen til kolonier, ha en betydelig innvirkning på infeksjonsutfall på grunn av varierende følsomhet mellom musestammer, som rapportert av andre39,40,41,50,51,52,53,54,55. Derfor bør begge tas i betraktning når man designer eksperimenter.
Etter en dødelig i.v. utfordring spredte soppceller seg raskt gjennom blodet og begynner å invadere flere organer, blant annet de mest berørte er nyrene41. Andre organer som påvirkes er hjernen, milten og benmargen48,56. Uansett er akutt sepsis den ultimate dødsårsaken på det tidlige tidspunktet punkt37. Som vist i de representative resultatene, sepsis alvorlighetsgrad kan kvantitativt vurderes av Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis (M-CASS) basert på utstilte tegn på en sepsis tilstand i utfordrede dyr43,57. Blant de flere surrogatmarkørene for dødelig sepsis har hypotermi blitt foreslått som en kritisk prediktor for overhengende død i både klinisk og eksperimentell sepsis43,58,59.
Selv om det ikke er utført noen formelle studier for å sammenligne innavlede vs. utavlede mus direkte i denne modellen, er data hentet fra den nåværende protokollen ved hjelp av utrasede sveitsiske Webster-mus usedvanlig reproduserbare i ulike sepsisparametere, til tross for antatt genetisk heterogenitet. Generelt er et mønster av dødelighet som faller innen 3-5 dager en fast modell av akutt sepsis, som det fremgår av rask økning i sepsis morbiditet og nivåer av inflammatoriske markører innen timer etter post-dødelig utfordring50,51. For lengre overlevelsestider (7-10 dager) er dødeligheten sannsynligvis et resultat av mikrobiell byrde som fører til dødelig vevsskade i målorganer og sentralnervesystemet. Valget av sepsis eller mikrobiell byrde kan brukes etter behov for å evaluere immunfunksjoner eller respons på antiinflammatoriske regimer eller antifungale terapier/vaksiner, som bestemt av inokulumet som brukes.
I tillegg til i.v. dødelig utfordringsmodell, intra-abdominal infeksjon med C. albicans hos mus via en i.p. utfordring kan også føre til spredt candidiasis og påfølgende sepsis, selv om co-inokulasjon med bakteriell patogen, Staphylococcus aureus, synergistisk forbedrer dødeligheten sammenlignet med C. albicans mono-infeksjon51,60,61. I den dødelige utfordringsmodellen er det nødvendig med vesentlig høyere mikrobiell inocula (1,75 x 107C. albicans/8 x 107S. aureus per mus) for å forårsake polymikrobiell peritonitt og spredning av organismene fra bukhulen inn i blodet. På samme måte fører gastrointestinal infeksjon med C. albicans hos mus behandlet med immundempende og / eller mucosal-skadelige midler til translokasjon av soppcellene i blodet og resulterer i sopp sepsis62,63. Til tross for de karakteristiske inokulasjonsrutene er mekanismen for påfølgende sopp sepsis i stor grad analog mellom de tre sykdomsmodellene, som involverer en ukontrollert systemisk proinflammatorisk respons på Candida som fører til organsvikt37,51,61. På samme måte, hos mennesker, er det denne prosessen med vertsresponsen, ikke bare candidemia, som forårsaker høy sykelighet / dødelighet forbundet med hematogent spredt candidiasis ervervet i helsevesenets innstillinger64,65.
Ved hjelp av den nåværende sopp sepsis-modellen demonstrerer vi her at beskyttelse mot dødelig C. albicans infeksjon kan oppnås ved i.v. pre-immunisering / vaksinasjon med C. dubliniensis (avirulent) eller svekket C. albicans mutanter, samtidig med betydelig reduksjon i sepsis morbiditet. Beskyttelsen formidles av medfødte Gr-1+ myeloid-avledede undertrykkerceller som ser ut til å bli indusert i benmargen som en form for trent medfødt immunitet66,67. Det arbeides med å utvide forståelsen av denne nye formen for medfødt immunmediert beskyttelse mot C. albicans blodstrømsinfeksjoner.
Til slutt har den innovative gnageroppvarmings-/restraining-enheten vært medvirkende til å fremme vår evne til å utføre i.v. injeksjoner av store multigruppe dyrestudier på en effektiv og effektiv måte. Som sådan har vi laget begrepet Mouse a Minute, for enheten. Enhetsspesifikasjonene er tilgjengelige fra den tilsvarende forfatteren på forespørsel om innkjøp av en lignende enhet. Teknikkene som er demonstrert her kan tjene som et nyttig verktøy i gnagermodeller som bruker hale vene injeksjoner over et bredt spekter av forskningsområder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av LSUHSC Foundation (PLF), og delvis av U54 GM104940 fra National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health, som finansierer Louisiana Clinical and Translational Science Center.
Candida albicans strain DAY185 | Carnegie Melon University | N/A | provided by the laboratory of Aaron Mitchell |
Candida albicans strain efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ | University of Tennessee Health Sciences Center | N/A | provided by the laboratory of Glen Palmer |
Candida dubliniensis strain Wü284 | Trinity College, Dublin, Ireland | N/A | provided by the laboratory of Gary Moran |
Mice | Charles River Laboratories | 551NCICr:SW | Female Swiss Webster; 6-8 weeks old |
Mice | Charles River Laboratories | 556NCIC57BL/6 | Female C57BL/6; 6-8 weeks old |
Needles, 27G, ½-in | Becton Dickinson | 305109 | can be substituted from other vendors |
Phosphate buffered saline (PBS) | GE | SH30028.02 | can be substituted from other vendors |
Rodent warming and restraining device (Mouse a Minute) | LSU Health | custom order | Mouse a Minute is available for custom ordering from LSU Health |
Sabouraud dextrose agar (SDA) | Becton Dickinson | 211584 | can be substituted from other vendors |
Syringes, 1 mL | Becton Dickinson | 309659 | can be substituted from other vendors |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Yeast peptone dextrose (YPD) broth | Fisher Scientific | BP2469 | can be substituted from other vendors |