オドナタにおけるエレクトロポレーション媒介性RNA干渉法

注: プロトコルの全体的なスキームは図 1に示されています。 トンボやダムリーの幼虫の準備。 ハンドネットを使用して現場で幼虫を収集します。注:私はセネガルの幼虫はしばしば水面に浮かぶ水の植物にしがみついているが、P.ゾナタ幼虫はしばしば底部の葉のごみの中にとどまる。筑波市では、3月から6月まで、そして5月から6月までは、I.セネガルの最終インスター幼虫が見つかっています。I. セネガルの幼虫は、実験室14の卵から飼育することができるが、現場で採取された幼虫は明らかに成人の出現の成功率が高い。 PCR増幅産物の制限フラグメント長多型(RFLP)による種同定。注:このステップは、種が幼虫の出現から識別することが困難である場合にのみ必要です , 私. 鉗子を使用して幼虫の尾子のエラの1つを保持します。その後、幼虫は尾大エラ自体から落ちる(オートトミーを引き起こす)。注:ザイゴプテランダムの幼虫は、通常、3つのコーダルエラを持っています(図1A)。彼らは捕食者に攻撃されたとき、彼らは脱出するために自分の尾のエラを脱ぐことができます。尾大のギルが利用できない場合、脚の一部が解剖される。 PBS溶液の100 μLに1つのコーダルギルを入れて [0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.115% Na2HPO4, 0.02% KH2PO4 (w/v)、 デポジットペスタを使用してミキサーハンドで均質化します。 混合物を5,000xgで10秒間スピンダウンし、上清の0.5μLをDNAポリメラーゼおよびプライマーを用いてPCR増幅し、核DNAの内部転写スペーサー1(ITS1)領域を増幅する。注: 製造元のプロトコルに従って PCR を実行します。ITS-F0(5′-GGA AAG ATGGCC AAA CTT GA -3′)と5.8S-AS1(5′-GCC GGC CCT CAG CCA G-3′)プライマーの組み合わせは、ほぼすべてのオドナタ種19でITS1領域を増幅することができる。 PCR増幅産物1μL、10x Mバッファー0.3μL、DraI制限酵素0.1μL、37°Cで1.6μLの水を1時間インキュベートします。注:種の組み合わせに応じて、最適な制限酵素を選択します。種同定に適した制限酵素がない場合は、DNAシーケンシングにより確認する。 2%アガロースゲルに染料を積み込んで2μLの製品をロードし、電気泳動を実行します。注:1%または1.5%アガロースゲルを使用する場合、種を同定することは困難です。 電気泳動パターンを調べて、種を特定します(図2)。注: RFLP パターンは、種依存および人口依存です。筑波人口では 、I.asiatica は400-500 bpの主要バンドを有するが、 一方、I.セネガル 人は、約200bpの主要バンドと100bp未満の追加バンドを有する( 図2の矢印頭)。ITS1領域はゲノム中の複数のコピーに存在し、 イシュヌラ 種では、ITS1領域内のマイクロサテライト多型が同じ個体に存在することが多く、RFLPSのパターンに影響を与える。 RNAiに使用するまで、実験室で収集した幼虫を後ろに下ろします。 各幼虫を約3mLの水で12ウェルプレートの各ウェルに別々に入れます。注: 私はセネガルの 幼虫は頻繁に互いにカニバリゼーションするので個別に飼わなければならないが 、P.ゾナタ 幼虫はめったにカニバライズしないのでグループに入れておくことができる。 毎日アルテミア塩水エビを含むセネテンシス幼虫と、RNAiに適した発達段階に成長するまで、少なくとも週に2回、血虫および/またはTubifexワームを含むP.ゾナタ幼虫を供給する。注:頻繁な給餌は、大人の出現の成功率を高めるために重要です。 水は、フェスや残り物で汚れるとすぐに交換します。注:頻繁な水の変化は、大人の出現の成功率を高めるためにも重要です。 RNAiの適切な発達段階を判断する。注意:I.セネガルの最後のインスター幼虫は、5つの発達段階14、20に分類することができます。第1段階(ステージA、翼が膨張し始める前)または最終段階(ステージB)は、成人出現後のRNAiの明確な表現型を考慮した場合に、RNAi実験に適している(議論参照)。P.ゾナタでは、翼拡張前の最終インスター幼虫(I.セネガルのステージAに対応)がこの研究で使用された。 2. RNAi用のdsRNA/siRNA溶液および注射針の調製 注: RNAi の溶液として、小さな干渉RNA (siRNA) (ステップ 2.1) または二本鎖 RNA (dsRNA) (ステップ 2.2) のいずれかを選択します。 siRNA溶液の調製 siDirectプログラムバージョン2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)21を使用してsiRNAを設計し、以前に報告されたガイドラインに従って、鱗翅目昆虫22. 市販の siRNA を得る。注:この研究で使用されたI.セネガルンシスのSiRNAの配列は、センスストランドの5′-GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3’、アンチセンス鎖に対する5′-UAU UGA UAA CGG AAAGUG CUC -3’でした。陰性対照として、siRNA標的の配列は、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子である:5′-GCA UCA AGG UGA ACU UcA AGA -3’センス鎖および5′-UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG-3’アンチセンス11に対する。 注射バッファー[100 mM CH3COOK、2 mM Mg(CH3COO)2、30mM HEPES-KOH、pH 7.4]22でsiRNAを100 μMに希釈します。 使用するまで-80°Cで保管してください。 dsRNA溶液の調製 primer3 プログラム バージョン 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23を使用して dsRNA の 300-400 bp 領域を選択し、プライマー セットを設計します。 市販の合成プライマーセットを得る。注:dsRNA合成用のテンプレートを作成するために、この研究で使用されるプライマーセットは、フォワードプライマー用の(5′-GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC-3’および5′-GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT AT -3’逆プライマー)のMCO2遺伝子(IsMCO2、アクセロン)の次の通りでした。LC589180)および(5′-CCG CAC AGC TGC TCA CTA TTC AA -3’フォワードプライマー用、および5′-GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA-3’リバースプライマー)(PzMCO2,加盟番号. LC589179)。陰性対照として、クローニングベクター上のβラクタマーゼ(bla)遺伝子を標的とするdsRNA用プライマーセットは、フォワードプライマーに対してCTA TGT GGC GCG GTA TTA T-3’および5′-CAG AAG AAG TGG TCC TGC AAC T-3’を逆プライマー用に設定した。 市販のRNA抽出キットを用いてオドナタ幼虫からRNAを抽出し、製造者のプロトコルに従って逆転写酵素を用いてcDNA合成を行います。注:RNAシーケンシング解析用に用意したcDNAライブラリも使用できます。 合成されたcDNAと設計されたプライマーセットを使用してターゲット配列を増幅し、製造業者のプロトコルに従って市販のリガーゼを使用してクローニングベクターにクローン化します。 プラスミドを 大腸菌 の有能な細胞に変換し、一晩のインキュベーション後に単一のコロニーを拾う。 PCR-ベクター上のプライマーを使用して挿入領域を増幅する。 サンガーシーケンスによってクローン化されたシーケンスを確認します。 PCR-増幅は、T7ポリメラーゼプロモーター配列24,25を含むベクタープライマーを用いてインサートを増幅する。注:この研究では、T7-F(5′ – TAA TAC GAC TCA CTAタグGGAタグGGAタグGGA T – 3′)およびT7-R(5′-TAA TAC GAC TCA CTAタグGGA GAC CCG GGG ATC CGA T – 3′) 25. メーカーのプロトコルに従ってPCR精製キットを使用してPCR製品を精製し、蒸留水を50μLでDNAを溶出し、遠心エバポレーターを使用して溶出したDNA溶液を約10μLに濃縮します。 メーカーのプロトコルに従ってインビトロ転写によってdsRNAを合成する。100 μLの溶出バッファーを持つ合計 1000 ng テンプレート DNA および溶出合成 dsRNA を使用します。 分光光度計を用いてdsRNAの濃度を測定し、1.5%アガロースゲル上の電気泳動によりdsRNAの品質を確認します。注: dsRNA 合成が成功すると、単一バンドが見られます。 溶出バッファーでdsRNAを1000 ng/μLに希釈し、使用するまで-20 °Cで保存します。 注射針の準備 ガラスの針の引き手を使用して、ガラスの毛細血管を引っ張ります。 引っ張られた毛細管の先端を両面粘着テープの上に置き、鉗子で毛細管の先端を壊します。 毛細管をインジェクタに設定します。注意:ニトリル手袋を着用すると毛細血管の扱い方が簡単です。 siRNA/dsRNA溶液を調製したキャピラリーにロードします。注:注入された毛細血管の先端が泥の中に住んでいたために汚れで詰まる可能性があるので、毛細血管を繰り返し使用しないでください。 3. siRNA/dsRNA注射 注意:手順は、ダムリー(ステップ3.1)とトンボ(ステップ3.2)のためにわずかに異なります。 ジゴプテラン(ダムリー)幼虫への注射(例えば、セネガル人)。 砕氷上の湿った紙で覆われた幼虫を50~70秒間麻酔します(図3A-C)。注:氷冷麻酔の持続時間は、幼虫の状態に依存します。幼虫が氷冷麻酔の70秒後に動き始めると、さらに70秒間の氷冷麻酔が加えられる。めったに動かない幼虫(例えば 、P.ゾナタ)では、この手順は必須ではありません。 プロソラックスの両側に2本のピンを取り付け、幼虫を固定スタンド(発泡スチロールの一部など)に固定します(図3D)。注: インジェクションの場所に応じて、ピンの位置と数を調整します。 腹部のRNAiの7番目と8番目の腹部セグメントの間、または手と鉗子を使用して胸郭のRNAiの前胸とシンソラックス(融合メソトルクとメタソラックス)の間のセグメント間膜を伸ばします。 セグメント間膜を手で伸ばしたままにします。 準備した毛細管の先端を伸ばされたセグメント間膜に挿入する(図3D、3F)。 1 μLのsiRNA/dsRNA溶液を注入します。 アニソプテラン(トンボ)幼虫(例えば 、P.ゾナータ)への注射。 幼虫の表面から水をペーパータオルで拭き取ります。 必要に応じて、プロソラックスの両側に2本のピンを取り付け、幼虫を固定スタンド(発泡スチロールの一部など)に固定します(図3H)。注: インジェクションの場所に応じて、ピンの位置と数を調整します。 P. ゾナタの場合、このステップで幼虫をピンで固定することは必須ではありません。 4番目と5番目の腹部セグメントの間のセグメント間膜を手で伸ばします。 第4と第5の腹部セグメント間のセグメント間膜に細かい針で小さな穴を作ります。注:この手順は、多くのアニソプテラン(トンボ)種に必要です。なぜなら、セグメント間膜はガラスの毛細管を直接挿入するのが難しすぎるからである。 準備された毛細管の先端を準備された穴に挿入します(図3I)。注: 図3Hに示すように、幼虫の背側の部分は成体の腹側に対応するため、図 3H-Jのように処理すると表現型が腹腹に現れます。 1 μLのsiRNA/dsRNA溶液を注入します。 4. 生体内エレクトロポレーション 必要に応じて、固定スタンド(発泡スチロールの一部など)に幼虫を固定するために、より多くのピンを追加します。 siRNA/dsRNA溶液の注入に続いて、鉗子を使用して幼虫表面に超音波ゲルの2つの液滴を適用する。 超音波ゲルに電極を置き、反対側にsiRNA/dsRNA溶液を注入した側に正極を、負極を反対側に置く(図3E、3G、3J)。 メモ:エレクトロポレーションの燃焼効果を避けるために、幼虫の表皮に直接触れないでください。 エレクトロポレーターを使用して10回のエレクトロポレーションパルス(それぞれ280 ms/s)を生成します。注:種、ステージ、組織に応じて、エレクトロポレーションの電圧を調整してください。本研究では、25 Vが I.セネガルに 適用され、45 V からP.ゾナタに適用された。 表面の残りのゲルをペーパータオルで拭き取ります。 治療した幼虫を濡れたペーパータオルの上に約1日置いて回復し、翌日に飼育ケースに移します。 5. サイト固有のフェノールチ分析 約10mLの水とペーパータオルを含むペトリ皿(直径5cm)に個別にI.セネガルを保管し、使い捨ての不織布メッシュ(エクロセンケージ14)を備えたプラスチックケージにP.ゾナタを入れておく。 私のセネガル人の場合、幼虫が食べるのをやめた後、使い捨ての不織布メッシュを持つプラスチックケージに個別に移動します。注意:同じケージに2匹以上の幼虫を入れないでください。そうでなければ、彼らは大人になった直後に互いにカニバリゼーションします。 成人の出現後、正極がエレクトロポレーションのために配置された領域の周りの表現型を観察し、撮影する。注: 表現型はパッチにのみ表示されます。多くの場合、未完了の色素沈着により、発覚直後に認識することは困難です。 RNAiの効率(例えば、定量的RT-PCR)を調べるために、表現型が目に見える場合は、領域を解剖し、表現型のない領域と比較します。注: RNAi表現型のレベル、すなわちキューティクル脱色のサイズと位置は、多くの場合、個人間でかなりの変動を示します( 図4参照)。 将来の分析のために100%EtOHで新興の成人を保ちます。注:オドナタ種のボディカラーは死後すぐに消えてしまうので、死ぬ前にエタノールに保存することが重要です。エタノールは時々昆虫を色分けし、そのような場合には昆虫が死ぬ前に凍結する。