JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Nasale poetsbemonstering en -verwerking met behulp van digitale hoge snelheid ciliaire videomicroscopie - aanpassing aan de COVID-19-pandemie

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Om een succesvolle en hoogwaardige ciliaire functionele analyse voor PCD-diagnose te garanderen, is een nauwkeurige en zorgvuldige methode voor respiratoire epitheelbemonstering en -verwerking essentieel. Om pcd-diagnostische service te blijven bieden tijdens de COVID-19-pandemie, is het ciliaire videomicroscopieprotocol bijgewerkt met passende infectiebeheersingsmaatregelen.

Abstract

Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een genetische beweeglijke ciliopathie, die leidt tot significante otosinopulmonale ziekte. PCD-diagnose wordt vaak gemist of vertraagd vanwege uitdagingen met verschillende diagnostische modaliteiten. Ciliaire videomicroscopie, met behulp van Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), een van de diagnostische hulpmiddelen voor PCD, wordt beschouwd als de optimale methode om ciliaire functionele analyse (CFA) uit te voeren, bestaande uit ciliaire beatfrequentie (CBF) en beat pattern (CBP) analyse. DHSV mist echter een gestandaardiseerde, gepubliceerde operationele procedure voor het verwerken en analyseren van monsters. Het maakt ook gebruik van levend respiratoir epitheel, een belangrijk probleem met infectiebeheersing tijdens de COVID-19-pandemie. Om tijdens deze gezondheidscrisis een diagnostische dienst te blijven bieden, is het ciliaire videomicroscopieprotocol aangepast om adequate infectiebeheersingsmaatregelen op te nemen.

Hier beschrijven we een herzien protocol voor bemonstering en laboratoriumverwerking van trilhaarmonsters van trilhaar, met de nadruk op aanpassingen die zijn gemaakt om te voldoen aan COVID-19-infectiebeheersingsmaatregelen. Representatieve resultaten van CFA van neusborstelmonsters verkregen van 16 gezonde proefpersonen, verwerkt en geanalyseerd volgens dit protocol, worden beschreven. We illustreren ook het belang van het verkrijgen en verwerken van epitheliale trilhaarstroken van optimale kwaliteit, aangezien monsters die niet voldoen aan de kwaliteitsselectiecriteria nu CFA mogelijk maken, waardoor de diagnostische betrouwbaarheid en de efficiëntie van deze techniek mogelijk afnemen.

Introduction

Primaire ciliaire dyskinesie (PCD) is een erfelijke heterogene beweeglijke ciliopathie, waarbij respiratoire trilharen stationair, langzaam of dyskinetisch zijn, wat leidt tot een verminderde mucociliaire klaring en chronische oto-sino-pulmonale ziekte 1,2,3,4. De klinische manifestaties van PCD zijn chronische natte hoest en chronische verstopte neus vanaf de vroege zuigelingentijd, terugkerende of chronische infecties van de bovenste en onderste luchtwegen die leiden tot bronchiëctasieën en terugkerende of chronische otitis media en sinusitis 5,6,7. Ongeveer de helft van de PCD-patiënten vertoont lateraliteitsdefecten zoals situs inversus of situs ambiguus. Sommige patiënten presenteren zich ook met onvruchtbaarheidsproblemen als gevolg van imbiel sperma bij mannen en immotiale trilharen in de eileiders bij vrouwen 1,2,8. PCD is zeldzaam, maar de prevalentie is moeilijk te definiëren en varieert van 1:10.000 tot 1:20.000 9,10. De werkelijke prevalentie van PCD wordt echter hoger geacht te zijn als gevolg van moeilijkheden bij de diagnose en een gebrek aan klinisch vermoeden. Symptomen van PCD bootsen gemeenschappelijke respiratoire manifestaties van andere acute of chronische respiratoire aandoeningen na, en de diagnostische uitdagingen van het bevestigen van de diagnose zijn bekend, wat leidt tot ontoereikende behandeling en follow-up 2,5,9,11.

Ciliaire videomicroscopie, met behulp van Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), is een van de diagnostische hulpmiddelen voor PCD 4,8,12,13. DHSV wordt beschouwd als de optimale methode om ciliaire functionele analyse (CFA) uit te voeren, bestaande uit ciliaire beatfrequentie (CBF) en beatpatroon (CBP) analyse 2,14,15,16. DHSV maakt gebruik van levend respiratoir epitheel, meestal verkregen uit neusborstelen13.

Met het oog op de huidige COVID-19-uitbraak is bevestiging van een PCD-diagnose nu nog belangrijker, omdat er aanwijzingen zijn dat onderliggende luchtwegaandoeningen kunnen leiden tot slechtere resultaten na COVID-19-infectie17,18. Een veilige en efficiënte pcd-diagnostische dienst tijdens de huidige pandemie zal bevestigde PCD-patiënten ook in staat stellen om te profiteren van aanvullende beschermende maatregelen, vergeleken met de algemene bevolking19.

Overdracht van COVID-19 vindt voornamelijk plaats via druppelverspreiding20. Een hoog potentieel voor overdracht van asymptomatische (of minimaal symptomatische) patiënten wordt gesuggereerd door de hoge virale lading in neusmonster20. Bovendien, als virale deeltjes worden verneveld, blijven ze minstens 3 uur in de lucht21. Daarom worden respiratoire gezondheidswerkers blootgesteld aan een hoog reservoir van virale lading tijdens het uitvoeren van klinische zorg en het verzamelen van monsters voor diagnostische technieken22. Bovendien stelt manipulatie van levende ademhalingsmonsters de technicus bloot aan COVID-19-besmetting. Terwijl best-practice aanbevelingen voor ademhalingsartsen en KNO-chirurgen die voor COVID-19-patiënten zorgen, worden geïmplementeerd23, is er een gebrek aan aanbevelingen voor het uitvoeren van DHSV tijdens de COVID-19-pandemie.

Om een PCD-diagnostische dienst te kunnen blijven leveren en tegelijkertijd de veiligheid van de gezondheidswerker (het uitvoeren van monsterafname) en de technicus (het uitvoeren van monsterverwerking) te waarborgen, moest het ciliaire videomicroscopieprotocol tijdens de COVID-19-pandemie worden aangepast. De techniek van ciliaire videomicroscopie is momenteel beperkt tot onderzoeksdiensten en gespecialiseerde diagnostische centra, omdat CFA uitgebreide training en ervaring vereist. Bovendien is er momenteel een gebrek aan standaardisatie en nauwkeurige werkwijze voor het verwerken en analyseren van monsters met behulp van DHSV 4,13.

Het doel van dit artikel is om standaard operationele procedures voor DHSV te beschrijven, met bijzondere aandacht voor infectiebeheersingsmaatregelen en veiligheid bij het bemonsteren en verwerken van levend neusepitheel. Hierdoor kunnen hoogwaardige PCD-diagnose en -zorg doorgaan, ondanks de huidige COVID-19-uitbraak.

Protocol

De goedkeuring werd verkregen van de ethische commissie van het Luikse ziekenhuis en de universitaire dienst voor hygiëne en gezondheidsbescherming op het werk. 1. Bemonstering van respireir ciliated epitheel Zorg ervoor dat proefpersonen gedurende ten minste 4-6 weken vrij zijn van infectie en vrij zijn van nasale en geïnhaleerde medicatie, voordat ze worden bemonsterd. Bereid het supplement M199-preparaat: Supplement Cell Culture Medium 199 (M199) (500 ml) met antibioti…

Representative Results

Om de efficiëntie van de techniek te illustreren, presenteren we de resultaten van de CFA in een reeks van 16 gezonde volwassen vrijwilligers (5 mannen, leeftijdscategorie 22-54 jaar). Neusborstelmonsters van 14 (4 mannen, leeftijdscategorie 24-54 jaar) van de in totaal 16 vrijwilligers leverden voldoende geschikte epitheliale randen op die voldeden aan de selectiecriteria die nodig zijn om CFA uit te voeren. Van deze 14 neusborstelmonsters werden in totaal 242 trilhaarranden geregistreerd en…

Discussion

Dit artikel is bedoeld om een standaard operationele procedure voor CFA te bieden met behulp van neusborstelmonsters, met aanpassingen voor passende infectiebeheersingsoverwegingen tijdens de COVID-19-pandemie. PCD-diagnose is een uitdaging en vereist momenteel een panel van verschillende diagnostische tests, volgens internationale aanbeveling, waaronder nasale stikstofmonoxidemeting, CFA met behulp van DHSV, ciliaire ultrastructurele analyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), etikettering van ciliai…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier en alle teamleden van het PCD-diagnostisch centrum van Paris-Est bedanken voor hun beschikbaarheid en hartelijke ontvangst tijdens het bezoek aan hun PCD-diagnostisch centrum en de vele uitwisselingen. We bedanken ook Robert Hirst en alle teamleden van het PCD-centrum van Leicester voor hun welkom en tijd, advies en expertise.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image