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生物工程

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

Published: February 24, 2021
doi:
10.3791/61937
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1Graduate Program in Bioengineering,University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Department of Pharmaceutical Chemistry,University of California San Francisco, 3Scribe Biosciences, 4Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences,University of California San Francisco, 5California Institute for Quantitative Biosciences,University of California San Francisco, 6Chan Zuckerberg Biohub,University of California San Francisco, 7Department of Chemical & Biomolecular Engineering,University of California Berkeley, 8Helen Wills Neuroscience Institute,University of California Berkeley, 9Department of Mechanical Engineering,University of California Berkeley, 10Center for Cellular Construction,University of California San Francisco

Summary

Aquí presentamos un protocolo para micropatrones de células a resolución unicelular utilizando adhesión programada por ADN. Este protocolo utiliza una plataforma de fotolitografía de sobremesa para crear patrones de oligonucleótidos de ADN en un portaobjetos de vidrio y luego etiqueta las membranas celulares con oligonucleótidos complementarios disponibles comercialmente. La hibridación de los oligos da como resultado la adhesión celularprogramada.

Abstract

El posicionamiento relativo de las células es una característica clave del microambiente que organiza las interacciones célula-célula. Para estudiar las interacciones entre células del mismo o diferente tipo, las técnicas de micropatrón han demostrado ser útiles. Dna Programmed Assembly of Cells (DPAC) es una técnica de micropatronaje que se dirige a la adhesión de las células a un sustrato u otras células mediante hibridación de ADN. Las operaciones más básicas en DPAC comienzan con la decoración de las membranas celulares con oligonucleótidos modificados con lípidos, luego las fluyen sobre un sustrato que ha sido modelado con secuencias de ADN complementarias. Las células se adhieren selectivamente al sustrato solo cuando encuentran una secuencia de ADN complementaria. Las células no adherentes se eliminan, revelando un patrón de células adherentes. Las operaciones adicionales incluyen rondas adicionales de adhesión célula-sustrato o célula-célula, así como la transferencia de los patrones formados por DPAC a un hidrogel de incrustación para cultivo a largo plazo. Anteriormente, los métodos para modelar oligonucleótidos en superficies y decorar células con secuencias de ADN requerían equipo especializado y síntesis de ADN personalizada, respectivamente. Informamos una versión actualizada del protocolo, utilizando una configuración de fotolitografía de sobremesa de bajo costo y oligonucleótidos modificados de colesterol (CMO) disponibles comercialmente implementados utilizando un formato modular. Las células etiquetadas con CMO se adhieren con alta eficiencia a sustratos con patrones de ADN. Este enfoque se puede utilizar para modelar múltiples tipos de células a la vez con alta precisión y para crear matrices de microtemas incrustadas dentro de una matriz extracelular. Las ventajas de este método incluyen su alta resolución, la capacidad de incrustar células en un microambiente tridimensional sin interrumpir el micropatronaje y la flexibilidad en el modelado de cualquier tipo de célula.

Introduction

El posicionamiento de las células entre sí en un tejido es una característica importante del microambiente1,2,3,4. Las técnicas utilizadas para modelar células vivas en arreglos controlados espacialmente son valiosas herramientas experimentales para estudiar la diferenciación4,5,6,7,8, motilidad celular9, morfogénesis10,11,12, metabolismo13e interacciones célula-célula7,14 . Existe una variedad de métodos para modelar células, cada una con sus propias ventajas e inconvenientes3,4. Los métodos que crean islas adhesivas de proteínas de matriz extracelular (ECM), como la impresión de microcontactos y las plantillas cortadas con láser, son simples y escalables. Sin embargo, es difícil modelar más de uno o dos tipos de células a la vez porque las propiedades adhesivas de diferentes tipos de células a diferentes moléculas de ECM son a menudo similares15,16,17. Se pueden crear micropatrones más complejos con la adsorción molecular inducida por la luz (LIMAP), una técnica que utiliza la luz UV para extirpar las regiones recubiertas de PEG y permitir la posterior adsorción deproteínas 18,19. Este proceso se puede repetir para crear micropatrón de alta resolución con múltiples tipos de células. Sin embargo, puede ocurrir una unión cruzada de las células a los diferentes parches de proteínas, lo que resulta en una especificidad de patrón deficiente19. Los métodos físicos como la siembra de células en dispositivos de cultivo reconfigurables micromecánicos pueden crear cocultivos estructurados con control dinámico, pero sin la flexibilidad en el diseño de patrones de la impresión de microcontactos o LIMAP14,8. A diferencia de las otras técnicas, la bioimpresión puede crear arreglos tridimensionales de células dentro de hidrogeles20,21. Sin embargo, las construcciones bioimpresas tienen una resolución mucho más baja que otras técnicas de micropatrones, con un tamaño de característica promedio del orden de cientos de micras22. Un método ideal de modelado celular tendría alta resolución, patrón múltiples tipos de células, usaría equipos y reactivos que sean fácilmente accesibles y tendría la capacidad de incrustar patrones exitosos en un hidrogel para cultivo celular tridimensional (3D). En este artículo, presentamos CMO-DPAC, una técnica de micropatrón celular que utiliza la flexibilidad y la velocidad de la hibridación de ADN para apuntar a la adhesión celular a un sustrato. Este método ha sido adaptado de nuestros protocolos anteriores23,24 para hacerlo más asequible, modular y accesible. Utilizando el protocolo actual, cualquier laboratorio debería poder configurar un sistema completamente funcional sin ningún equipo especializado o experiencia.

Dna Programmed Assembly of Cells (DPAC) es una poderosa técnica de ingeniería de tejidos que modela las células a resolución de una sola célula con un control preciso sobre el espaciamiento célula-célula y la geometría del tejido. En DPAC, las membranas celulares están decoradas con oligonucleótidos de ADN (oligos) utilizando dos oligos modificados con lípidos diseñados para hibridarse en la membrana celular. Debido a que los oligos se conjugan con lípidos hidrófobos, se dividen rápidamente en la membrana celular25 donde se hibridan, aumentando la hidrofobicidad neta de las moléculas no unidas covalentemente y, por lo tanto, mejorando su vida útil en la superficie celular26. Los oligos se presentan en la superficie celular de una manera en la que pueden hibridarse con oligos complementarios en otras células o portaobjetos de vidrio funcionalizados con ADN para crear patrones celulares 2D o 3D definidos con composición prescrita, espaciado célula-célula y geometría23,24. Los microtejidos modelados se pueden separar de la superficie enzimáticamente e incrustarse en un hidrogel para un cultivo 3D prolongado. Cuando se usan en combinación con células primarias o células madre, las colecciones resultantes de células pueden sufrir morfogénesis y formarse en organoides23,27,28. DPAC se ha aplicado para investigar la dinámica del destino de las células madre neurales adultas en respuesta a señales competidoras6,29,para estudiar la autoorganidad de las células epiteliales mamarias23,28,y para generar “origami tisular” a través de la condensación mesenquimal27.

DPAC permite la colocación precisa de múltiples poblaciones celulares y tiene una resolución sustancialmente mejor que las bioimpresoras basadas en extrusión (del orden de micras)22,23. Además, a diferencia de los métodos de modelado basados en ECM, como la impresión por microcontacto, DPAC no requiere la adhesión diferencial de los diferentes tipos de células a una superficie recubierta de ECM15,23. Es ideal para responder preguntas sobre cómo la composición de un tejido afecta su comportamiento, cómo las células integran múltiples señales celulares y microambientales al tomar decisiones6,29y cómo los pares de células interactúan entre sí. Una ventaja de este método sobre otros métodos de micropatrones es que se puede utilizar para el cultivo celular 3D en un solo plano de imagen, facilitando los estudios de lapso de tiempo de la autoorganidad tisular y la morfogénesis organoide23,27,30.

A pesar de estas ventajas, la implementación exitosa de DPAC ha requerido la síntesis de reactivos de oligonucleótidos personalizados y el acceso a equipos especializados para el modelado de ADN23,24, limitando la adopción generalizada. Por ejemplo, los oligos modificados con lípidos (OVM) óptimos utilizados en el protocolo original deben sintetizarse a medida, modificarse con ácido lignocérico o ácido palmítico y purificarse26. Este proceso requiere el uso de un sintetizador de ADN y un instrumento de cromatografía líquida de alto rendimiento, así como la compra de los reactivos asociados como la metilamina, una sustancia controlada que está sujeta a regulaciones institucionales y federales. Como alternativa, los OVM se pueden comprar a medida a granel, pero esto requiere una inversión inicial significativa en la tecnología.

Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una versión revisada de DPAC que utiliza oligos modificados con colesterol (CMO) disponibles comercialmente en lugar de los OVM sintetizados a medida. Para reducir aún más los costos y aumentar la flexibilidad de la plataforma, hemos cambiado a un sistema modular de tres oligo. En lugar de ordenar un nuevo oligo modificado con colesterol para cada población celular única, un usuario de este protocolo puede usar los mismos oligos modificados con colesterol (“Universal Anchor” y “Universal Co-Anchor”) para cada población celular y luego emplear un oligo económico y no modificado (“Adapter Strand”) que se hibrida tanto con el Universal Anchor como con el ADN funcionalizado con aminas en la superficie o el Adapter Strand de otro tipo de célula.

Otra limitación del protocolo DPAC original fue que creó las diapositivas con patrones de ADN mediante el uso de una impresora líquida de alta resolución (por ejemplo, Nano eNabler, BioForce Nanosciences)23,24. Si bien este instrumento cuenta con una resolución extraordinaria y bajos requisitos de reactivos, no está disponible para la mayoría de las instituciones y tiene una tasa de impresión relativamente baja (aproximadamente 1 característica con patrón por segundo). Recientemente, se han desarrollado dos métodos fotolitográficos para modelar las características del ADN en las superficies. Viola y sus colegas utilizaron un recubrimiento de poliacrilamida y benzofenona que une covalentemente oligos de ADN monocatenario tras la exposición a la luz UV30. Usando este método, pudieron crear andamios de tejido que sufrieron cambios de forma programados a gran escala como resultado de la contractilidad celular y la autoorganización. Scheideler et al. desarrollaron un método que utiliza la exposición UV de una fotorresistente positiva para exponer selectivamente oligos de ADN modificados con aminas a una diapositiva funcionalizada con aldehído29. Después de la cocción y la aminación reductiva, el ADN modificado con aminas se une covalentemente a la superficie. Este método se utilizó para investigar la respuesta de las células madre neurales adultas a las señales de autorrenovación y diferenciación presentadas espacialmente. Este artículo adapta el protocolo de Scheideler et al. para crear los patrones de ADN que capturarán las células etiquetadas con CMO. Este protocolo de fotopatrones se puede realizar sin usar una sala limpia. Utiliza equipos económicos y disponibles comercialmente que se despliegan fácilmente en una mesa de trabajo o campana extractora de humos. El uso de equipos de fotolitografía de bajo costo o bricolaje (hágalo usted mismo) aumenta la accesibilidad para los investigadores sin acceso a instalaciones de salas limpias y permite a los investigadores probar la técnica sin una gran inversión de tiempo o recursos31,32. Sin embargo, se puede lograr una mejor resolución y la alineación de múltiples características de ADN mediante el uso del recubrimiento de espín comercial y el alineador de máscaras que se encuentran comúnmente en las instalaciones de salas limpias.

Aquí, describimos un método para modelar células a resolución de una sola célula utilizando la adhesión basada en ADN. En primer lugar, el fotopatrón con una fotorresistción positiva se utiliza para crear patrones de alta resolución de ADN modificado con aminas sobre un sustrato de vidrio modificado con aldehído. A continuación, la diapositiva se trata para reducir la unión celular no específica y se crean celdas de flujo PDMS para confinar las células sobre regiones modeladas. Las células se etiquetan con oligonucleótidos cortos de ADN que se funcionalizan con colesterol y, como resultado, se insertan en la membrana celular. Las células fluyen sobre los micropatrones de ADN. La hibridación entre el ADN de la superficie celular y el ADN en la superficie del vidrio da como resultado una adhesión específica de las células al patrón de ADN. Las células no adherentes se eliminan, revelando el patrón de células adherentes. Este proceso se puede repetir para modelar múltiples tipos de células o para crear estructuras de varias capas. Si se desea, las células se pueden integrar completamente en un ECM para el cultivo celular 3D.

Protocol

1. Experimento de diseño Planifique el experimento deseado, teniendo en cuenta el tamaño de las características, el espaciado de las características, el número de tipos de células involucradas y la disposición de las células entre sí. Consulte el Archivo Suplementario 1,una guía para el diseño experimental, y el Archivo Suplementario 2,que contiene secuencias oligo de ejemplo. Fotomáscara de diseño utilizando software de diseño asistido por ordenador. Se proporciona una fotomáscara de ejemplo en el archivo suplementario 3. Dibuje un rectángulo de las dimensiones de un portaobjetos de microscopio estándar (25 mm x 75 mm). Dibuja cuatro regiones rectangulares de 10 mm de ancho y 10 mm de largo, distribuidas uniformemente a lo largo de la diapositiva. Dentro de cada región, dibuje entidades que sean del tamaño, la forma y el espaciado deseados para el experimento. Las células se adherirán solo a estas características en el experimento. Para crear fotomáscaras alineadas para varios tipos de celda, cree un dibujo maestro con todos los conjuntos de entidades y, a continuación, guarde las versiones que correspondan a cada tipo de celda. Solicite una fotomáscara de transparencia de alta resolución (al menos 20,000 puntos por pulgada) de este dibujo CAD con las características dibujadas en 1.2.3 transparente y las regiones más grandes en negro. 2. Fotopatrones de ADN en diapositivas funcionalizadas con aldehído (protocolo adaptado de Scheideler et al.29 ) Si modela múltiples tipos de células, fabrique marcadores fiduciarios en la diapositiva funcionalizada con aldehído antes de cualquier patrón de ADN para facilitar la alineación de las características. Los métodos alternativos para crear marcadores fiduciarios se sugieren en el Archivo Suplementario 1. Para crear marcadores fiduciarios metálicos, aplique la fotorresistencia positiva S1813 como se describe en los pasos 2.3 a 2.11. Use una fotomáscara que contenga características grandes que serán fáciles de alinear más adelante. Incorpore estas características en el diseño de las fotomáscaras que se utilizarán para el modelado de ADN. Deposite una película delgada (100 Angstroms) de titanio en la corredera utilizando la evaporación de la pistola de electrones29. Retire el exceso de metal y fotorresistidad con acetona, y luego proceda al fotopatrón de ADN. Preparar una solución de 20 μM de un oligo modificado con 5′-amina en tampón de ADN (50 mM de fosfato de sodio en agua, pH = 8.5). Consulte el Archivo Suplementario 2 para ver las secuencias de oligo sugeridas.NOTA: Es posible utilizar tan solo 5 μM de oligo modificado con amina para algunos patrones y aplicaciones, por lo que es posible que sea necesario optimizar la concentración de ADN en la superficie. Precalentar una placa caliente a 100 °C. Use cinta adhesiva de doble cara o una aspiradora para conectar un portaobjetos de vidrio funcionalizado con aldehído al rotor de un revestimiento de centrifugado.PRECAUCIÓN: El desprendimiento de deslizamiento durante el recubrimiento por centrifugado es un riesgo para la seguridad. Siempre use el revestimiento de centrifugado en un recipiente cerrado con tapa, como una caja de acrílico.NOTA: Etiquete una esquina de la diapositiva usando un escriba de diamante o un implemento similar para rayar el vidrio. Esto ayuda con la identificación y orientación de la diapositiva después de que la fotorresistencia ha sido lavada. Use una pipeta desechable para dejar caer la fotorresistente positiva en la diapositiva de aldehído. Para recubrimientos uniformes, agregue pequeñas gotas de la fotorresistción a través de la diapositiva, en lugar de una gota grande en el medio(Figura suplementaria 1A). Usando el recubrimiento de centrifugado, gire la corredera a 3000 rpm durante 30 s. Coloque la diapositiva sobre una placa de 100 °C durante 1,5 min (horneado suave) para cotelar la fotorresistidad. Retire la diapositiva de la placa caliente. Coloque una fotomáscara con las características deseadas para este experimento en la parte superior de la diapositiva y pese la fotomáscara con un trozo de vidrio(Figura suplementaria 1B, C). Cubra toda la configuración en una caja opaca (Figura suplementaria 1D). Exponer con una lámpara UV (longitud de onda de 365 nm, 360 mW, 5 pulgadas de deslizamiento, densidad total de energía radiante 100 mJ/cm2) durante 2 min.NOTA: La luz UV romperá los enlaces poliméricos en la fotorresistente debajo de las regiones transparentes de la fotomáscara, creando regiones donde el ADN más tarde podrá adherirse. Desarrolle la diapositiva sumergiéndose en la solución de desarrollador durante 3-5 min (Figura suplementaria 1E). Enjuague el exceso de solución reveladora con agua. Secar bajo una corriente de aire o nitrógeno. (Figura suplementaria 1F). Confirme que la fotolitografía fue exitosa mirando la diapositiva bajo el microscopio. Debido a que la fotorresistción es sensible a la luz UV, realice este paso rápidamente y luego guarde la diapositiva en la oscuridad mientras prepara otras diapositivas (si corresponde).NOTA: Una diapositiva con un patrón correcto debe tener aristas definidas nítidamente para cada función, sin agrietamiento y sin distorsión de la función en los bordes. Ejemplos de fotolitografía correcta e incorrecta se proporcionan en la Figura Suplementaria 2A. Consulte la Tabla 1 para obtener sugerencias para solucionar problemas si la fotolitografía no proporciona la calidad de característica deseada. Agregue una gota de la solución oligo modificada con amina de 20 μM (Paso 2.1) en cada región fotopatronada de la diapositiva. Use una punta de pipeta para extender suavemente la gota por toda la región, teniendo cuidado de no rayar la diapositiva. (Figura suplementaria 1G). Hornea el portaobjetos en un horno de 65-70 °C hasta que la solución de ADN se haya secado completamente sobre la superficie del portaobjetos (aproximadamente 1 h). Realice la aminación reductora colocando las diapositivas estampadas y horneadas en un plato de cultivo celular de 15 cm y colóquelos en una campana extractora sobre una coctelera. Pesar 100 mg de borohidruro de sodio. En una campana extractora de humos, agregue 40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), mezcle suavemente y agregue al plato que contiene las diapositivas estampadas. Deje que la reacción continúe durante 15 minutos con un suave agitación.NOTA: La amina en el oligo primero forma una base de Schiff con los aldehídos en la superficie de la diapositiva. Este es un enlace covalente reversible que debe convertirse en un enlace irreversible antes de su uso en DPAC. La adición de un agente reductor (borohidruro de sodio) convierte la base de Schiff en una amina secundaria por aminación reductora.PRECAUCIÓN: La reacción del borohidruro de sodio con agua crea gas hidrógeno y continuará haciéndolo durante horas o días después de que comience la reacción. Realice la etapa de aminación reductora en una campana de humos y mantenga todos los residuos de solución de borohidruro de sodio en un recipiente abierto o con tapa suelta en la campana de humos durante al menos 24 horas. Elimine el ADN no reaccionado lavando dos veces con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% en agua, luego tres veces con agua destilada. Seque el tobogán bajo una corriente de nitrógeno o aire. Enjuague la diapositiva con acetona para eliminar la fotorresistia restante.NOTA: En este punto, el ADN se ha unido irreversible y covalentemente a la diapositiva y todos los grupos funcionales de aldehído no reaccionados se han convertido en alcoholes. La fotorresistción ya no es necesaria. Si se modelarán varios oligos, vuelva al paso 2.4, alinee la fotomáscara con las marcas fiduciales y repita.NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Almacene las diapositivas en un desecador al vacío. En condiciones secas, los portaobjetos se pueden almacenar hasta 3 meses sin pérdida de calidad. 3. Hacer diapositiva hidrofóbica (opcional) (protocolo adaptado de Todhunter et al.24 ) NOTA: Es ventajoso, pero no obligatorio, modificar la química de la superficie de la diapositiva para hacerla más inerte e hidrofóbica. La unión celular no específica se reduce en estas superficies33, aliviando así la unión no específica de las células a áreas no modeladas de la diapositiva. Además, si las células modeladas finalmente se incrustarán dentro de un hidrogel y se transferirán fuera de la diapositiva, el tratamiento de la superficie es esencial para el movimiento confiable del hidrogel cargado de células a través de la diapositiva sin distorsión ni desgarro. La silanización con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil) dimetilclorosilano da como resultado la presencia de grupos fluoroalquilo hidrófobos en la superficie del portaobjetos. PRECAUCIÓN: Realice todos los pasos desde 3.1 en adelante en una campana de humos químicos para evitar la exposición a los vapores de ácido acético y cloruro de metileno. Enjuague el portaobjetos con ácido acético al 10% y luego séquelo bajo una corriente de aire. En un frasco de coplin de vidrio, prepare una solución de 60 ml de cloruro de metileno (diclorometano), 0,6 ml de trietilamina y 0,6 ml de dimetilclorosilano (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo). Revuelva con una espátula de metal para mezclar.NOTA: Estos reactivos son sensibles al agua. Deben almacenarse en condiciones secas y utilizarse lo más frescos posible. Agregue la diapositiva al frasco de Coplin que contiene la solución de silano. Coloque el frasco Coplin en un agitador orbital (ajustado a 60-80 rpm) y permita que la reacción del silano y la corredera progrese durante 15 minutos. Use forrceps de metal para quitar la corredera de la solución de silano. Sumerja el portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga cloruro de metileno durante 1 minuto para eliminar el exceso de silano del portaobjetos. Sumerja la diapositiva en un tubo cónico de 50 ml que contenga etanol. Agitar. Sumerja el portaobjetos en un tubo cónico de 50 ml que contenga agua destilada. Agitar.NOTA: El cloruro de metileno y el agua no son miscibles, por lo que se necesita un enjuague con etanol para eliminar el exceso de cloruro de metileno antes del enjuague final con agua. Retire el tobogán del agua e inspecciónelo. El tobogán debe estar bastante seco, con gotas de agua que tengan un ángulo de contacto superior a 90°. Deje que las diapositivas se sequen completamente y guárdelo al vacío hasta su uso.NOTA: El experimento se puede pausar aquí. Guarde el tobogán en condiciones secas. 4. Prepare las celdas de flujo PDMS y la diapositiva para el experimento NOTA: Las celdas de flujo PDMS rectangulares se utilizan para concentrar las celdas sobre las regiones modeladas de la diapositiva. Para experimentos cultivados en 3D, las células de flujo forman un molde para el hidrogel. Haga su maestro SU-8 para usar como molde para células de flujo PDMS. Precalentar la placa a 95 °C. Agregue 5 ml de SU-8 2075 a una oblea de silicio. Gira el SU-8 en la oblea a 500 rpm durante 10s, seguido de 1,000 rpm para 30s. Esto debería crear características de hasta 240 μm de altura34. Hornea suavemente la oblea en la placa caliente durante al menos 45 min. Retire la oblea de la placa caliente. Coloque la fotomáscara (consulte el Archivo suplementario 4)(emulsión de lado hacia abajo) en la parte superior de la oblea y pésquela con un disco de vidrio para garantizar el contacto entre la fotomáscara y la diapositiva. Exponer con luz UV (365 nm) para una densidad de energía radiante de 350 mJ/cm2. Hornea la oblea en la placa caliente durante 12-15 min. Coloque la oblea en un recipiente de vidrio ancho. Cubierta de oblea con solución de desarrollador SU-8. Coloque en una coctelera y desarrolle mientras agita durante al menos 15 minutos. Use forrceps para quitar la oblea de la solución de desarrollador. Enjuague durante 5 s rociando más solución de revelador de una botella de chorro. Rocíe con alcohol isopropílico para enjuagar. Si aparece un precipitado blanco, devuelva la oblea a la solución del desarrollador y desarrolle durante más tiempo. Oblea seca bajo una corriente de aire o nitrógeno. Hornea el tobogán durante 5 min.NOTA: Una vez que se ha creado la oblea maestra, se puede reutilizar indefinidamente siempre que las características permanezcan intactas. Preparar PDMS. En un bote de pesaje, agregue elastómero de polidimetilsiloxano y el reticulador en una proporción de 10: 1 (en masa). Revuelva vigorosamente para asegurar una mezcla uniforme. Des-gase el PDMS en un desecador de vacío durante 15-30 minutos hasta que no se ven más burbujas. Coloque la oblea maestra en una placa de cultivo de tejidos de 15 cm. Vierta PDMS sobre la oblea. Si aparecen burbujas, des-gas en un desecador de vacío durante unos minutos. Hornear en horno a 60 °C durante 3 h.NOTA: Después de hornear, las células de flujo PDMS se pueden almacenar en la mesa de trabajo indefinidamente. Prepare las células de flujo pdmS para el experimento. Poco antes de comenzar un experimento CMO-DPAC, elimine el número requerido de células de flujo PDMS de la oblea maestra. El plasma se oxida con 10 cc/min de aire ambiente durante 90 s para que la superficie sea hidrófila. Recorte cada celda de flujo individual para que quede 1-2 mm de PDMS en cada lado, luego abra la parte superior e inferior de la celda de flujo para crear una entrada y salida. Recuperar diapositivas con patrones creadas en los pasos 2 y 3. Alinear en la parte superior de la fotomáscara. Usando la fotomáscara como referencia, coloque las celdas de flujo PDMS en la diapositiva en la ubicación de cada región con patrón. Agregue 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 1% de albúmina sérica bovina (BSA) a la entrada de cada célula de flujo, como se muestra en la Figura Suplementaria 1H. Confirme que la celda de flujo está completamente llena por el PBS + 1% BSA y que no hay burbujas grandes. Continúe inmediatamente con los pasos 5 y 6.NOTA: El bloqueo con BSA minimiza la adhesión de células no específicas a la superficie de la diapositiva. 5. Levantar y etiquetar las células con ADN modificado con colesterol Prepare las soluciones de ADN modificadas con colesterol. Para cada conjunto de células en el experimento, mezcle 3 μL de una solución madre de 100 μM de la hebra de anclaje universal modificada con colesterol con 3 μL de una solución madre de 100 μM de una hebra adaptadora. Incubar durante 1 minuto. Esto pre-hibridará los oligos. Agregue 69 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para crear una solución de anclaje universal + adaptador de 4 μM. Para cada conjunto de células en el experimento, agregue 3 μL de una solución madre co-anchor strand modificada con colesterol universal de 100 μM a 12 μL de PBS, creando una solución de 20 μM. Preparar la(s) suspensión(es) unicelular(es). Para las células adherentes, use tripsina u otro agente de disociación para eliminar las células del matraz de cultivo. Agregue medios de cultivo para neutralizar la tripsina y centrífuga para peletizar las células. Para las células no adherentes, recoja la suspensión celular y centrífuga para peletizar las células. Resuspend el pellet celular en 1 ml de PBS helado o medios libres de suero. Transfiera 1-3 millones de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga a 160 x g durante 4 min.NOTA: Si el tipo de célula que se está utilizando es propenso a aglutinarse / agregarse, use PBS sin iones de calcio y magnesio para todos los pasos de lavado para reducir la agregación celular no deseada. Si la viabilidad es una preocupación particular para el tipo de célula que se está utilizando, use medios sin suero en lugar de PBS. Los medios que contienen suero fetal bovino no se recomiendan para el etiquetado celular, ya que pueden dificultar la incorporación de oligos modificados con lípidos. 35 Etiquete las células con oligos modificados con colesterol. Resuspend el pellet celular en 75 μL de PBS helado o medios sin suero. Mantenga las células en un cubo de hielo durante todo el proceso de etiquetado y lavado para maximizar la viabilidad celular y minimizar la pérdida de los oligos modificados con colesterol de la superficie celular.NOTA: La reutilización de las células antes de agregar el ADN asegura que la distribución del ADN sea uniforme en toda la población celular. Agregue los 75 μL de la solución Universal Anchor + Adapter de 4 μM creada en el paso 5.1.1 al tubo de microcentrífuga que contiene la suspensión celular. Mezclar bien mediante pipeteo. Incubar durante 5 min sobre hielo. Añadir 15 μL de la solución universal de coanclar al tubo de la microcentrífuga. Mezclar bien mediante pipeteo. Incubar durante 5 min sobre hielo. Eliminar el exceso de oligos de la suspensión celular. Agregue 1 ml de PBS helado o medios sin suero al tubo de la microcentrífuga. Mezclar con una pipeta P1000. Centrifugar a 160 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Repetir dos veces más.NOTA: Si las células son propensas a aglutinarse, pase la suspensión celular a través de un filtro de 40 μm antes del lavado final. Si las células son propensas a la adsorción en el lado del tubo de la microcentrífuga, considere la posibilidad de prebloquear el tubo con caseína. 6. Modelar las células etiquetadas con ADN Resuspónda las células en PBS helado o medios libres de suero para crear una solución densa celular de al menos 25 millones de células/ ml.NOTA: Para una diapositiva que utilice cuatro de las celdas de flujo PDMS de 10 mm x 15 mm x 200 μm descritas en el Paso 4, se requieren aproximadamente 100 μL de esta suspensión de células densas. Aunque la mayoría de estas células no se adherirán al patrón y finalmente se descartarán, tener una solución extremadamente concentrada de células sobre el patrón mejora drásticamente la eficiencia del patrón celular. Levanta la corredera e inclóla ligeramente. Agregue 25 μL de suspensión celular a la entrada de cada celda de flujo en la diapositiva estampada. Retire la solución PBS + 1% BSA de la salida, permitiendo que la suspensión de la celda llene la celda de flujo PDMS. Incubar en hielo o a temperatura ambiente durante 30 s.NOTA: En este punto, mirar la célula de flujo bajo un microscopio debe mostrar células densamente empaquetadas con poco o ningún espacio visible entre las células. Véase la figura complementaria 2B. Aspire 5 μL de suspensión celular desde la salida de la corredera y agréguela de nuevo a la entrada. Repetir 10 veces por celda de flujo.NOTA: La adhesión de las células etiquetadas con CMO a la diapositiva con patrón de ADN es casi instantánea. El flujo de las células sobre el patrón varias veces aumenta la probabilidad de que una célula fluya sobre un punto de ADN dado y sea capturada. Pipete suavemente PBS o medios sin suero en la entrada de cada célula de flujo para eliminar el exceso de células. Recoja la suspensión de la celda de la salida. Repita 2-4 veces o hasta que una inspección visual de la diapositiva bajo el microscopio confirme que no quedan exceso de células.NOTA: Puede ser ventajoso guardar el exceso de células desde el primer lavado. Si la eficiencia del patrón no es satisfactoria, el exceso de células se puede centrifugar y resuspendir en un volumen más bajo de PBS para crear una solución más densa en células, y luego el proceso se puede repetir desde el Paso 6.2. Repita los pasos 6.1 a 6.4 para cada conjunto de celdas del patrón. Para los patrones en los que varios tipos de celda están directamente modelados por la plantilla de superficie, comience con el tipo de celda menos abundante del patrón y termine con el tipo de celda más abundante.NOTA: Es aconsejable hacer cada ronda de ensamblaje celular secuencialmente en lugar de agrupar las células, incluso en condiciones en las que todas las células están etiquetadas con secuencias de ADN ortogonales. La agrupación de las células diluye efectivamente cada población celular y reduce la eficiencia de los patrones. Una vez completada la ronda final de ensamblaje de células, los siguientes pasos variarán según el experimento específico. Si las células están destinadas a permanecer en el vidrio, agregue medios a una placa de Petri que contenga la diapositiva y luego use suavemente fórceps para empujar las celdas de flujo PDMS fuera de la diapositiva. Si las células se incrustarán en un hidrogel y se cultivarán en 3D, continúe con el Paso 7. 7. Transferencia al hidrogel para cultivo 3D (opcional) Prepare una solución precursora de hidrogel que contenga DNasa al 2%.NOTA: La composición de la solución variará en función de la configuración experimental. Matrigel y mezclas de Matrigel y colágeno I funcionan bien en este protocolo, pero también son posibles otros hidrogeles. Añadir 50 μL de solución de hidrogel que contenga DNasa al 2% a la entrada de cada célula de flujo. Aspire el exceso de líquido desde la salida, impulsando la solución de hidrogel hacia la celda de flujo. Para los precursores de hidrogel viscoso, puede ser necesario inclinar ligeramente la diapositiva para ayudar a que el hidrogel fluya hacia la celda de flujo. Incubar el portaobjetos a 37 °C durante 30-45 min (dependiendo de la cinética de gelificación del hidrogel) para permitir que el hidrogel se fije y escinda la adhesión basada en ADN entre las células y la superficie. Retire cada celda de flujo de la diapositiva y colóquela encima de la solución precursora de hidrogel. Agregue 50 μL de precursor de hidrogel a un pozo de un portaobjetos de cámara de 2 pozos o una placa de 6 pozos. Pipeta 10 μL de PBS a cada lado de cada celda de flujo. Use una cuchilla de afeitar o pinzas de punta fina para distribuir el PBS a lo largo de toda la longitud de la celda de flujo, luego levante suavemente los lados de la celda de flujo para que el PBS se precipite debajo del hidrogel.NOTA: Esto hará “flotar” el hidrogel a través de la diapositiva, lo que permite la transferencia sin distorsión ni desgarro. Use una cuchilla de afeitar para mover suavemente la celda de flujo hasta el borde del portaobjetos de vidrio. Invierta la diapositiva. Con la hoja de afeitar, empuje la celda de flujo fuera de la corredera para que aterrice sobre la hoja de afeitar. Recoge la celda de flujo de la hoja de afeitar con pórceps curvos. Invierta la celda de flujo para que las células estén en la parte inferior y luego colóquela encima de la gota de solución precursora de hidrogel. Repita los pasos 7.4.1 a 7.4.6 para cada celda de flujo. Incubar durante al menos 30 minutos para que el hidrogel que contiene las células modeladas pueda unirse a la capa inferior de hidrogel, lo que resulta en la incrustación completa de las células modeladas. Extraiga la celda de flujo PDMS. Agregue suficientes medios para sumergir la celda de flujo PDMS.NOTA: La afluencia de medios aflojará la adhesión entre el hidrogel y la célula de flujo PDMS. Use forrórceps curvas, orientadas a lo largo del eje largo de la celda de flujo, para empujar suavemente la celda de flujo hasta que salga y flote en el medio. Recoge la celda de flujo con pórceps y deséchala.NOTA: Para obtener resultados óptimos, extienda las pórceps curvas y aplique una presión suave a las paredes de la celda de flujo PDMS. Aplique fuerza en la dirección del eje largo de la celda de flujo. 8. Confirme el etiquetado exitoso de las celdas con CMO (opcional, para la solución de problemas) Ordene un oligonucleótido modificado fluorescentemente (FAM o AF647) que sea complementario a la secuencia de adhesión superficial de la hebra adaptadora que se está utilizando en el experimento. Etiquete las células con ADN CMO y lave el exceso de ADN como se describe en el Paso 5. Resuspend en 200 μL de PBS helado. Ensanche una solución de 4 μM del oligonucleótido complementario náutico de marca fluorescente en PBS. Añadir 200 μL de esta solución a la suspensión celular. Incubar en hielo durante 5 min. Agregue 1 ml de PBS helado. Mezclar. Centrifugar las células para peletizarlas. Retire el sobrenadante. Repita este proceso dos veces más para eliminar cualquier ADN que no se haya hibridado. Realizar citometría analítica de flujo para cuantificar la presencia de ADN en la superficie celular. En un citómetro de flujo, analice las células de control que no han sido etiquetadas con ADN. Establezca puertas basadas en esta población. Analizar las células etiquetadas con CMO que han sido tratadas con un oligonucleótido complementario etiquetado fluorescentemente. Calcular la intensidad media de fluorescencia.

Representative Results

Este protocolo permite modelar células en 2D y 3D con alta precisión y sin el uso de reactivos personalizados o costosos equipos de sala limpia. La Figura 1 muestra una visión general del protocolo. En primer lugar, las diapositivas funcionalizadas con ADN se crean a través de la fotolitografía. A continuación, las células se etiquetan con CMO. Las células fluyen sobre la diapositiva, donde se unen solo a las regiones funcionalizadas por ADN de la diapositiva. Después de que se elimina el exceso de células, se revela el patrón deseado de células. Estas células pueden cultivarse en el portaobjetos o incrustarse en un hidrogel que contenga DNasa y transferirse fuera del portaobjetos para el cultivo celular en 3D. El etiquetado de células con CMO permite su unión a la diapositiva con patrón de ADN(Figura 2). En primer lugar, el Universal Anchor Strand modificado con colesterol está prediridado con el Adapter Strand. A continuación, la solución Universal Anchor + Adapter se mezcla 1:1 con la suspensión de celda. El colesterol en el complejo Universal Anchor + Adapter se inserta en la membrana celular. La adición de la Hebra de Co-Anclaje Universal modificada con colesterol, que se hibrida con la Hebra de Ancla Universal, mejora la estabilidad del complejo CMO en la membrana celular al aumentar la hidrofobicidad neta del complejo26. Después de lavar el exceso de ADN de la suspensión celular, las células fluyen sobre el portaobjetos. La hibridación entre la hebra adaptadora y la cadena de ADN superficial da como resultado la unión de células a las regiones con patrones de ADN de la diapositiva. El patrón de las células se crea mediante el uso de fotolitografía para restringir la unión de oligos de ADN modificados con aminas a regiones específicas de una diapositiva de vidrio modificada con aldehído29 (Figura 3A). La fotorresistción positiva se recubre con espín en una diapositiva funcionalizada con aldehído. A continuación, se coloca una fotomáscara de transparencia en la parte superior de la diapositiva y la diapositiva se expone a la luz UV. Después del desarrollo, las regiones de la diapositiva que fueron expuestas a la luz UV ya no están recubiertas de fotorresistidad y, por lo tanto, han expuesto grupos de aldehídos. Una solución de 20 μM de oligos de ADN modificados con aminas se deja caer sobre el portaobjetos y se extiende para cubrir las regiones modeladas. La cocción seguida de una aminación reductiva da como resultado un enlace covalente entre el ADN modificado con aminas y el portaobjetos. Sorprendentemente, este proceso se puede repetir para modelar múltiples oligos sin ninguna pérdida de funcionalidad de los oligos previamente modelados(Figura 3B). Sin embargo, se debe tener cuidado de evitar patrones superpuestos, lo que resulta en la presencia de ambos oligos a una concentración reducida (Figura suplementaria 3). Múltiples poblaciones celulares se pueden modelar secuencialmente mediante el uso de hebras adaptadoras que difieren en su dominio modular (las 20 bases más cercanas al extremo 3′). Aunque este protocolo de fotopatrones fue desarrollado por Scheideler et al. en el contexto de una sala limpia, hemos demostrado que es posible lograr resultados similares con una configuración de fotolitografía económica y “casera” que cabe fácilmente dentro de una campana de humos químicos. La configuración incluye un recubrimiento de centrifugado de $ 400 hecho de un motor de CC, un controlador digital y una caja de pasteles de CD, así como una lámpara UV que se ensambló a partir de componentes individuales y se alojó en un contenedor de objetos punzantes reutilizado(Figura suplementaria 1). La principal ventaja de la configuración de fotolitografía casera es que es muy asequible (< $ 1000 por todo el equipo) al tiempo que puede crear características del tamaño de una sola celda. Sin embargo, el uso de equipos de bajo costo tiene sus limitaciones, por ejemplo, es más difícil alinear con precisión los marcadores fiduciarios para modelar múltiples oligos de ADN sin el uso de un alineador de máscara. Recomendamos esta configuración de fotolitografía económica para laboratorios que no tienen acceso conveniente a una sala limpia o que desean probar este método sin una gran inversión. Para identificar las condiciones óptimas para la adhesión celular programada por ADN, variamos sistemáticamente las concentraciones de hebras de ADN en las superficies celulares y medimos la eficiencia de la adhesión celular a las superficies de vidrio modificadas con ADN. La concentración de Universal Anchor + Adapter Strand y Universal Co-Anchor en soluciones de etiquetado se varió en varios órdenes de magnitud(Figura 4A,B),lo que resultó en 104 – 106 complejos de ADN por célula(Figura suplementaria 4). La adhesión celular fue dependiente de la dosis, con una adhesión celular mínima al patrón de ADN cuando las células fueron etiquetadas con CMO a una concentración de 0.05 μM o menos, y alta ocupación a una concentración de 2.5 μM y más. Por lo tanto, utilizamos una solución de 2 μM de Universal Anchor + Adapter Strand y una solución de 2 μM de Universal Co-Anchor en la mayoría de los experimentos. También se esperaría que la adhesión celular disminuya si la cantidad de ADN utilizada en la superficie del vidrio disminuye29 o si aumentan los desajustes entre la hebra adaptadora y la hebra superficial. Se proporciona más información sobre el diseño de la secuencia Adapter Strand en el archivo complementario 2. El etiquetado cmO utilizando hebras adaptadoras sin repeticiones de CpG no estimuló TLR9 en células HEK que expresan TLR9 de ratón(Figura suplementaria 5). Proporcionamos varias demostraciones de que el protocolo revisado proporciona una adhesión celular reproducible y eficiente programada por ADN. Por ejemplo, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVÉCs) etiquetadas con CMO se adhirieron a patrones de ADN con alta eficiencia. HuVECs etiquetados por CMO adheridos, así como HUVECs etiquetados como LMO (Figura 5A). Las células modeladas con CMO-DPAC conservaron su viabilidad y funcionalidad. Las células etiquetadas con CMO fueron teñidas por calceína AM y homodímero de etidio para evaluar la viabilidad (Figura suplementaria 6). Las diferencias en la viabilidad en comparación con las células de control no etiquetadas fueron pequeñas (94% vs 97%). Los MDCK individuales modelados a través de CMO-DPAC y transferidos a Matrigel fueron capaces de proliferar y polarizarse correctamente después de 5 días de cultivo(Figura 5B). DPAC también proporciona un medio para elaborar patrones de células en la tercera dimensión(Figura 5C). Por ejemplo, se pueden crear agregados multicapa y multicelulares alternando capas de células etiquetadas con CMO complementarios(Figura 5C). Estos experimentos demuestran que el protocolo es reproducible, no afecta negativamente la viabilidad o funcionalidad celular y produce patrones celulares que se pueden cultivar con éxito dentro de un solo plano de imagen en un ECM 3D. Al proporcionar secuencias de ADN ortogonales para dirigir la adhesión celular, DPAC proporciona un medio para modelar múltiples tipos de células en una sola superficie. Para implementar esta característica de DPAC, los patrones de ADN generados por la fotolitografía deben estar alineados entre sí. Los marcadores fiduciarios metálicos depositados en la diapositiva permitieron la alineación de múltiples fotomáscaras y, por lo tanto, el modelado de múltiples tipos de células a la vez. Los MCF10A teñidos con diferentes tintes únicos fueron etiquetados con CMO ortogonales y modelados para crear una visualización de los logotipos de UC Berkeley y UCSF(Figura 6). Este experimento demuestra que múltiples poblaciones celulares únicas pueden ser modeladas juntos con alta precisión y sin contaminación cruzada. El modelado exitoso de células utilizando CMO-DPAC requiere fotolitografía de alta calidad, concentración suficiente de oligo en la superficie celular, una alta densidad de células sobre el patrón y suficiente lavado. El fracaso de cualquiera de estos pasos afecta el resultado final. La Figura Suplementaria 2 incluye imágenes de ejemplo de fotolitografía correcta e incorrecta (Figura Suplementaria 2A), la densidad celular deseada sobre el patrón para crear patrones completamente ocupados ( Figura Suplementaria2B), la pérdida de células estampadas debido a pipeteo demasiado vigoroso durante los pasos posteriores de DPAC(Figura Suplementaria 2C), y la aglomeración no deseada de células ( Figura Suplementaria2D). La Tabla 1 incluye una lista de puntos de error comunes y la solución de problemas sugerida. Se recomienda el uso de oligos complementarios fluorescentes como herramienta de resolución de problemas para confirmar la presencia de ADN modelado en el portaobjetos y la presencia de CMO en la superficie celular mediante citometría de flujo (ver Paso 8 del protocolo). Figura 1: Descripción general del protocolo CMO-DPAC. Primero, se crea una diapositiva con patrón de ADN recubriendo una diapositiva de vidrio funcionalizada con aldehído con una fotorresistidad positiva, cubriéndola con una máscara de transparencia en el patrón deseado y exponiéndola a la luz UV. La fotorresistción expuesta a los rayos UV se lava con revelador, dejando las regiones expuestas del deslizamiento de aldehído y permitiendo la unión del ADN funcionalizado con aminas a la superficie. Las células se etiquetan con CMO y fluyen sobre la superficie. El ADN en la membrana celular se hibrida con el ADN en la superficie, lo que resulta en la adhesión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2:Las células se etiquetan con CMO en un proceso gradual. En primer lugar, el Universal Anchor Strand modificado con colesterol está prediridado con el Adapter Strand. A continuación, la solución Universal Anchor + Adapter se mezcla con la suspensión de celda. El colesterol en el complejo Universal Anchor + Adapter se inserta en la membrana celular. Después de la incubación, la hebra de anclaje universal modificada con colesterol se agrega a la suspensión celular, donde se hibrida con la hebra de anclaje universal y se inserta en la membrana celular. La adición de la segunda molécula de colesterol aumenta la hidrofobicidad neta del complejo de ADN y lo estabiliza dentro de la membrana26. Después de lavar el exceso de ADN, las células se concentran y se agregan a una célula de flujo PDMS en la parte superior de la superficie modelada. El extremo 3′ de la hebra adaptadora se hibrida con la hebra de ADN superficial en el portaobjetos de vidrio, lo que resulta en la adhesión a la diapositiva específicamente en regiones funcionalizadas con ADN complementario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3:La fotolitografía se utiliza para crear las diapositivas con patrones de ADN que en última instancia dictarán la colocación de las células. (A) Visión general del proceso de fotolitografía. Una diapositiva funcionalizada con aldehído está recubierta de espín con una fotorresistción positiva. La luz UV brilla sobre la diapositiva a través de una fotomáscara de transparencia que es transparente donde se desea la adhesión celular. Después de que se desarrolla la diapositiva, las regiones que anteriormente estaban expuestas a la luz UV ahora tienen grupos aldehídos expuestos. Una solución de 20 μM de un oligo de ADN funcionalizado con aminas se deja caer sobre el portaobjetos y se extiende sobre las regiones modeladas. La diapositiva se hornea entonces para inducir la formación de enlaces de Schiff (C = N) entre los grupos amina y aldehído, un enlace covalente reversible29. La aminación reductiva posterior con borohidruro de sodio al 0,25% en PBS convierte la base de Schiff en una amina secundaria por aminación reductiva, lo que resulta en un enlace irreversible entre el ADN y el portaobjetos. La fotorresistción restante se puede eliminar enjuagando con acetona. (B) Este proceso se puede repetir para crear patrones de ADN multicomponente y, por lo tanto, realizar experimentos con múltiples poblaciones celulares. (i) Después de que el primer oligo es modelado, la diapositiva se recubre de nuevo en fotorresistción y el protocolo procede como antes. La alineación de las fotomáscaras utilizando marcadores fiduciarios es necesaria para modelar múltiples hebras de ADN. (ii) Cada tipo de celda que se está modele difiere en el dominio modular de 20 bases de la hebra adaptadora. Mediante el uso de conjuntos ortogonales de oligos complementarios, se pueden modelar múltiples tipos de células sin adhesión cruzada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:La adhesión de las células etiquetadas con CMO a los patrones de ADN aumenta en función de la concentración de CMO durante el etiquetado. En este experimento, el Universal Anchor + Adapter Strand (pre-hibridado) y el Universal Co-Anchor se utilizaron a concentraciones iguales. La concentración se refiere a la concentración de CMO en la suspensión celular durante el etiquetado de CMO de las células. (A) Cuantificación del porcentaje de manchas de ADN de 15 μm de diámetro que fueron ocupadas por células MCF10A etiquetadas con CMO en función de la concentración de CMO durante el etiquetado celular. Los datos representados como la media ± desviación estándar de tres experimentos. (B) Imágenes representativas de los patrones de ADN (magenta) y MCF10As adheridos (cian) a diferentes concentraciones de CMO. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5:CMO-DPAC se puede utilizar para crear patrones celulares bidimensionales que posteriormente se pueden incrustar en un hidrogel tridimensional para cultivo y / o capas para crear estructuras de múltiples capas. (A) Comparación directa entre las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVÉCs) etiquetadas con CMO y las HUVECs etiquetadas con LMO adheridas a un patrón de ADN lineal. Ambos métodos de etiquetado celular dan como resultado una ocupación de casi el 100% del patrón de ADN. (B) Las células renales caninas individuales de Madin-Darby (MDCK) que expresan H2B-RFP se modelaron en puntos de 15 μm de diámetro espaciados a 200 μm de distancia y posteriormente se incrustaron en Matrigel. Después de 120 h de cultivo, los quistes epiteliales resultantes se fijaron y teñieron para E-cadherina, actina y colágeno IV. El esferoide en caja blanca se muestra en detalle. Barra de escala = 50 μm. (C) Las estructuras celulares de múltiples capas se pueden crear etiquetando poblaciones celulares separadas con hebras adaptadoras complementarias y patrones secuencialmente para que cada nueva adición de células se adhiera a la capa celular anterior. (i) Un esquema del patrón secuencial de poblaciones celulares para crear estructuras de múltiples capas. ii) Los agregados celulares de tres capas de MCF10A (visualizados usando tintes) se crearon utilizando este proceso. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Se pueden modelar múltiples tipos de células sin contaminación cruzada o pérdida de adherencia. Múltiples oligos de ADN modificados con aminas se modelaron secuencialmente en un portaobjetos de aldehído y se alinearon mediante el uso de marcadores fiduciarios metálicos. Tres poblaciones de MCF10A (cian, magenta, amarillo) se tiñeron con tintes únicos etiquetados con CMO complementarios y se estamparon en la diapositiva, lo que resultó en una imagen de los logotipos de UC Berkeley y UCSF. Barra de escala de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura suplementaria 1: Imágenes de ejemplo de la configuración de fotolitografía de sobremesa. (A) Deslice sobre el recubrimiento de espín, cubierto con fotorresistente positivo, antes del recubrimiento de centrifugado. (B) Imagen de la fotomáscara de transparencia. (C) Durante la exposición, la fotomáscara se intercala entre la diapositiva recubierta de fotorresistción y un disco de vidrio. (D) La carcasa para la lámpara UV se hizo de un contenedor de objetos punzantes reutilizado. (E) Diapositiva inmersa en la solución del desarrollador. (F) Diapositiva desarrollada. (G) Solución de ADN modificada con aminas esparcida en regiones modeladas de la diapositiva. (H) Celdas de flujo PDMS colocadas en la parte superior de las regiones modeladas de la diapositiva.   Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 2: Algunos ejemplos de fallos comunes de este protocolo. (A) (i) La cocción inferior antes de la exposición a los rayos UV o el desarrollo excesivo de características posteriores a la exposición pueden dar lugar a características que tienen bordes irregulares y pueden ser de tamaño irregular. (ii) Un ejemplo de una diapositiva correctamente fotopateada que tiene bordes limpios alrededor de las características, un tamaño de función uniforme y sin grietas obvias en el patrón. Barra de escala = 50 μm. (B) La densidad celular es crítica para la eficiencia del patrón. Al observar las células en la parte superior del patrón bajo un microscopio, deben existir pocos espacios entre las células, como lo demuestra la imagen de ejemplo de la izquierda. Barra de escala = 50 μm. (C) Las células modeladas pueden ser sensibles a las fuerzas fluidas que surgen del pipeteo demasiado vigoroso, que puede dañar y desalojar las células modeladas. Los agregados celulares de múltiples capas son particularmente vulnerables, ya que una célula en la parte inferior soporta una estructura de múltiples células. (i) Una matriz de agregados celulares incrustados con éxito en Matrigel. (ii)Una cuadrícula de agregados celulares que se desprendieron como resultado de pipetear matrigel viscoso demasiado vigorosamente. (D) Puede producirse una aglomeración de células, particularmente con células epiteliales. Estos grupos suelen ser homotípicos, pero pueden ser heterotípicos (células que se adhieren a células ya modeladas de un tipo diferente) si las células son particularmente pegajosas. La imagen muestra que tres poblaciones diferentes de MCF10A fueron modeladas en una matriz compuesta por tres manchas de ADN diferentes de tamaño unicelular (15 μm). La mayoría de las manchas de ADN tienen 2-4 células unidas. La aglomeración se puede resolver mediante el tratamiento con EDTA o filtrando los grupos antes del patrón. Barra de escala = 100 μm.   Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 3: La superposición de fotopatrón da como resultado la presencia de ambos oligos a una concentración reducida. Dos oligos ortogonales modificados con aminas fueron fotopatronados secuencialmente, primero una línea vertical (Strand 1), seguida de una línea horizontal que se superpuso a ella (Strand 2). Los oligos se visualizaron luego por hibridación con oligos complementarios fluorescentes. (A) Imagen de fluorescencia de la hebra 1. (B) Cuantificación del perfil de fluorescencia de la hebra 1 sobre una línea vertical de 100 μm que abarca la superposición. (C) Imagen de fluorescencia de la hebra 2. (D) Cuantificación del perfil de fluorescencia de la hebra 2 sobre una línea horizontal de 100 μm que abarca la superposición. Barra de escala = 50 μm.   Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 4: Cuantificación de complejos de ADN en la superficie celular en función de la concentración de etiquetado CMO. Los HUVÉCs se etiquetaron con diferentes concentraciones de solución de CMO, se lavaron y luego se incubaron con una hebra complementaria fluorescente. Se utilizó un kit de microesfera MESF (Moléculas de Fluorocromo Soluble Equivalente) para hacer citometría de flujo cuantitativa y estimar el número de complejos de ADN en la superficie celular en función de la concentración de CMO durante el etiquetado.   Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 5: El etiquetado de CMO no estimula la respuesta TLR9. Se llevó a cabo un experimento para ver si el etiquetado CMO activaría el mecanismo de detección de ADN de TLR9 y si esto se vería afectado por los CpG en la secuencia adapter Strand. Las células HEK que expresan TLR9 de ratón se incubaron durante la noche con 0,2 μM de ODN 1826 (un agonista TLR9 que contiene CpG), CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Strand que contiene la misma secuencia que ODN 1826 (CMO-CpG), o CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Strand que contiene una secuencia similar pero con reemplazo de los CpGs con GpCs (CMO-GpC). La estimulación TLR9 daría lugar a la producción de PAES (fosfatasa alcalina embrionaria secretada). La secreción del PAES se cuantificó mediante un ensayo colorimétrico (absorbancia). Las condiciones de tratamiento se compararon con las células en reposo que solo se trataron con PBS. La incubación con CMO-GPC no estimuló la expresión de TLR9. La incubación con CMO-CpG fue ligeramente más alta que las células en reposo, pero mucho más baja que ODN-1826.   Haga clic aquí para descargar este archivo. Figura suplementaria 6: Viabilidad de las células después del proceso de etiquetado de CMO. Para evaluar cómo el protocolo afecta la viabilidad, los HUVEC se dividieron en cuatro poblaciones: una permaneció en hielo durante 1 h, una fue etiquetada con PBS pero por lo demás se tomó a través de todos los pasos de centrifugación y lavado, una fue etiquetada con CMO y otra fue etiquetada con CMO y filtrada a través de un filtro de 40 μm para eliminar grumos. Las células se tiñeron con calceína AM y homodímero de etidio para evaluar el número de células vivas y muertas. Todos los tratamientos resultaron en una viabilidad significativamente menor que el control de hielo (ANOVA unidireccional con análisis post-hoc de Tukey), pero la viabilidad mediana para el etiquetado CMO (con o sin filtrado) fue de aproximadamente el 94%. Datos recopilados de tres experimentos independientes. * = p < 0,05. = p < 0.0001   Haga clic aquí para descargar este archivo. Resultado Posible(s) causa(s) Correcciones sugeridas Fotolitografía: las características están agrietadas Horneado suave inconsistente o inadecuado Aumente el tiempo de horneado suave hasta 3 minutos; verificar la temperatura real de la placa caliente y aumentar la temperatura según sea necesario Fotolitografía: las características no son nítidas o tienen fotorresistia que permanece dentro de ellas. Subdes desarrollo Aumentar el tiempo que la diapositiva pasa en la solución del desarrollador; incorporar agitación suave Fotolitografía: características inconsistentes en todas las diapositivas La luz UV puede no estar centrada o no enfocada correctamente Ajuste la configuración de la luz UV para garantizar una luz colimada de intensidad uniforme Las células no se adhieren a manchas estampadas con alta eficiencia No hay suficiente ADN en la superficie Confirme que el ADN está presente en la superficie hibridando el portaobjetos con oligos complementarios fluorescentes y luego obteniendo imágenes bajo el microscopio. Las células están inadecuadamente etiquetadas con CMO Añadir oligos complementarios fluorescentes a la suspensión celular y confirmar la fluorescencia mediante citometría de flujo No hay suficientes células sobre el patrón Recolectar células lavándolas de la célula de flujo PDMS, centrifugar y volver a suspenderlas en un volumen más bajo para concentrar las células Demasiado CMO restante en suspensión celular, hibridando con ADN en la diapositiva Agregue otro paso de lavado. Asegúrese de quitar la mayor cantidad posible de sobrenadante con cada lavado. Demasiada internalización de CMO debido al tiempo y la temperatura Trabajar rápidamente después de etiquetar las células con CMO; mantenga las células y deslícese sobre hielo y use reactivos helados Agrupación de células Las células no se separaron adecuadamente durante la tripsinización Use PBS + 0.04% EDTA durante los lavados celulares; pasar la suspensión de la celda a través del filtro de 35 μm antes del lavado final Las células se adhieren de forma no específica Si se encuentra en un área específica, podría deberse a arañazos en la diapositiva, desalineación de las células de flujo PDMS o derrame de ADN fuera de la región del patrón Evite arañazos, tenga cuidado de alinear las celdas de flujo PDMS con la región del patrón Si las células se adhieren a todas partes: bloqueo o lavado inadecuados Agregue más lavados después de modelar las células; pipetee más vigorosamente durante los lavados; bloquear con BSA al 1% durante más tiempo antes de comenzar el modelado celular; deslizar silanizar (paso opcional 3) o confirmar que la silanización fue exitosa midiendo el ángulo de contacto de la gota de agua Se forman burbujas dentro de la celda de flujo Errores de pipeteo, superficie hidrofílica desigual creada durante la oxidación del plasma Si las burbujas son pequeñas, agregue PBS a la entrada de la celda de flujo y pueden lavarse. Si las burbujas son más grandes, aplique una presión suave a la celda de flujo PDMS, empujando las burbujas hacia la entrada o salida. Las células inicialmente se adhieren al patrón, pero se eliminan durante los lavados, el patrón de otros tipos de células o la adición del precursor de hidrogel Las fuerzas de cizallamiento del pipeteo demasiado vigorosamente pueden hacer que las células se desprendan de la superficie. Pipetear más suavemente durante los lavados posteriores, rondas de patrones celulares o agregar precursores de hidrogel. Debido a que los precursores de hidrogel son viscosos, es más probable que causen que el patrón se desaloje, así que tenga precaución adicional. Las estructuras de múltiples capas tienden a ser pesadas y son más susceptibles a ser desalojadas. Deformaciones de tejido durante la transferencia 3D Palos de hidrogel para deslizar Confirme la hidrofobicidad de la diapositiva utilizando mediciones de ángulo de contacto Use una cuchilla de afeitar para levantar PDMS completamente en ambos bordes, lo que permite que PBS flote debajo del tejido Esto puede suceder con los hidrogeles de colágeno puro: considere ajustar la concentración de proteínas o la composición del hidrogel. Las células no se transfieren con el hidrogel y permanecen en la diapositiva Aumentar la concentración de Turbo DNAse o aumentar el tiempo de incubación El hidrogel no es lo suficientemente sólido Aumentar el tiempo de incubación y/o el mecanismo de gelificación del hidrogel en cuestión (por ejemplo, para el colágeno, asegúrese de que el pH sea correcto) Desgarros de hidrogel al extirpar el PDMS Haga que las células de flujo PDMS sean hidrófilas utilizando la oxidación por plasma antes de comenzar el experimento para que se desprendan fácilmente al agregar medios. Use las pórceps muy suavemente para separar el PDMS. Tabla 1: Una guía de solución de problemas para identificar y resolver posibles fallos que pueden surgir de este protocolo. En particular, la mala adhesión de las células al patrón puede tener muchas causas fundamentales y esta guía debería ayudar con la identificación y resolución de esos problemas. Expediente complementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente complementario 2.   Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente complementario 3. Haga clic aquí para descargar este archivo. Expediente complementario 4. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para el modelado de alta resolución de células en 2D y 3D para experimentos de cultivo celular in vitro. A diferencia de las versiones publicadas anteriormente de este método, el protocolo presentado aquí se centra en la usabilidad: no requiere equipos altamente especializados y todos los reactivos se pueden comprar a los proveedores en lugar de requerir una síntesis personalizada. A diferencia de otros métodos de micropatrón celular, este método es rápido e independiente del tipo celular: no requiere una adhesión específica a las proteínas de la matriz extracelular15. Las células modeladas por CMO-DPAC pueden incrustarse dentro de una matriz extracelular como Matrigel o colágeno, lo que resulta en cultivos 3D con una resolución espacial mucho más alta de lo que es posible actualmente con los métodos basados en la impresión por extrusión22. CMO-DPAC se puede utilizar para crear cientos o miles de características microscópicas por diapositiva, lo que permite realizar muchas réplicas al mismo tiempo.

Uno de los parámetros más importantes en el éxito de este protocolo es la densidad de celdas agregadas a las celdas de flujo en la parte superior de la diapositiva con patrón. Idealmente, la densidad debe ser de al menos 25 millones de células/ml. Cuando se carga en las células de flujo, esta densidad de células da como resultado una monocapa de células casi cerrada por encima del patrón(Figura suplementaria 2B). Estas altas densidades celulares maximizan la probabilidad de que una célula se asiente directamente sobre un punto de ADN y se adhiera. La reducción de la densidad celular disminuirá la eficiencia general del patrón. Otro paso crítico en este protocolo es volver a suspender completamente las células en PBS o medios libres de suero antes de agregar la solución de CMO. Los CMO se dividen muy rápidamente en las membranas celulares y la adición de la solución de CMO directamente a un pellet celular dará como resultado un etiquetado heterogéneo de las células. Después de agregar la solución de CMO a la suspensión celular, es importante mezclar bien mediante pipeteo para que las células se etiqueten uniformemente con los CMO. Después de las incubaciones, es necesario lavar a fondo el exceso de CMO a través de múltiples pasos de centrifugación y lavado. El exceso de CMO libre presente en la suspensión celular se unirá al ADN modificado con aminas patrón en el portaobjetos de vidrio, bloqueando la hibridación y la adhesión de las células modificadas por CMO en suspensión. El tiempo también es una consideración clave para este protocolo. Es importante trabajar lo más rápido posible cuando se usan CMO y mantener las células en hielo para minimizar la internalización de los CMO y maximizar la viabilidad celular. Los experimentos de citometría de flujo han demostrado que los CMO no persisten tanto tiempo en la superficie celular como los OVM, con una pérdida del 25% de los complejos de CMO durante dos horas de incubación en hielo36. Además, la viabilidad de las células disminuirá a medida que aumente el tiempo de manejo de las células. La viabilidad se puede maximizar trabajando rápidamente, manteniendo las células en hielo, usando reactivos helados y usando medios libres de suero para proporcionar algunos nutrientes.

Aunque CMO-DPAC puede ser una forma poderosa de estudiar la biología celular mediante el modelado de células con alta precisión, tiene sus limitaciones. Los experimentos CMO-DPAC pueden ser desafiantes, particularmente porque la complejidad experimental se agrega con múltiples tipos de células, capas o cultivo celular 3D(Archivo suplementario 1). Los fallos experimentales pueden ser comunes al iniciar este protocolo, como se describe en la Tabla 1. Por lo tanto, recomendamos que los usuarios instituyan controles de calidad (confirmando que el ADN está presente en la diapositiva, confirmando que las células están suficientemente etiquetadas con ADN (Paso 8), confirmando que el exceso de células se ha lavado a fondo, etc.) para asegurarse de que el experimento tenga éxito e identificar los pasos que pueden requerir una mayor optimización. Esperamos que la información proporcionada en este manuscrito y sus archivos complementarios ayuden a facilitar cualquier solución de problemas requerida.

El colesterol es una molécula bioactiva cuya internalización puede influir en el metabolismo celular, la expresión génica y la fluidez de la membrana37,38. Un estudio previo comparó los efectos sobre la expresión génica de las células etiquetadas con CMO y LMO utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula. Las células HEK etiquetadas con CMO habían alterado la expresión génica en comparación con las células no etiquetadas y etiquetadas con LMO36. El etiquetado de células con CMO resultó en la expresión diferencial (> 1,5 veces) de ocho genes en relación con los controles no etiquetados, incluido AP2B1, que se ha relacionado con el transporte de colesterol y esfingolípidos (GeneCards), y MALAT1, un ARN largo no codificante que regula la acumulación de colesterol39. Aunque menores, estas respuestas transcripcionales pueden ser preocupantes si el experimento en cuestión está estudiando el metabolismo, la dinámica de la membrana u otras vías asociadas al colesterol en las células.

Este protocolo es flexible y se puede ajustar para satisfacer las necesidades de cada experimento. Debido a que el CMO se inserta en la membrana lipídica en lugar de usar cualquier receptor específico, el método es agnóstico de tipo celular (huvés, MCF10As, HEKs y MDCKs se han demostrado aquí). Aunque el colesterol es un ancla hidrofóbica diferente a nuestros OVM publicados anteriormente, hasta ahora hemos encontrado que se comportan de manera similar. Por lo tanto, esperaríamos que los CMO trabajen con cualquiera de la amplia variedad de tipos de células que hemos publicado previamente con los OVM, incluidas, entre otras, las células madre neurales, los fibroblastos, las células mononucleares de sangre periférica, las células tumorales y las células epiteliales mamarias primarias6,23,27,29,36 . El etiquetado cmo no estimula TLR9, lo que sugiere que el protocolo es compatible con las células inmunes. La incorporación de membrana del CMO es una función del tamaño total de la célula y el grado de carga negativa en la célula glicocáliz35. Por lo tanto, hemos incluido un protocolo (Paso 8) para probar el alcance de la incorporación de la membrana que es susceptible de una optimización rápida. Las características específicas de cada patrón celular inevitablemente variarán según el diseño experimental (consulte el Archivo suplementario 1 para obtener más orientación). Aunque se recomienda el protocolo de fotopatronaje descrito anteriormente para modelar el ADN, cualquier método de confinamiento espacial de gotas de solución de ADN de amina debería funcionar, como el uso de impresoras de gotas de alta resolución. La resolución del patrón y el espaciado mínimo de las funciones variarán según el método utilizado. También es teóricamente posible combinar las secciones de fotopatrones de ADN de este protocolo con otros métodos que se han utilizado para etiquetar células con ADN, como con ADN hibridado a dedos de zinc expresados en membrana40,utilizando ADN conjugado con NHS41,y reaccionando residuos de ácido azido siálico en la superficie celular con ADN conjugado con fosfina42 . CMO-DPAC se puede aplicar a una variedad de experimentos que requieren un control estricto sobre el espaciamiento célula-célula, incluidos estudios de las interacciones entre pares de células, experimentos de coculto que analizan la transferencia de señales de células “emisoras” a células “receptoras” e investigaciones del efecto de las señales extracelulares cercanas en la diferenciación de células madre6,29 . El método también se puede utilizar para crear microtemas que se pueden utilizar para estudiar la migración celular en tres dimensiones, la autoorganización de las células en tejidos23,27, y la interacción dinámica entre las células y el ECM27. Esperamos que este protocolo proporcione a los investigadores una plataforma accesible para explorar nuevas aplicaciones de patrones celulares basados en ADN de alta resolución en sus propios laboratorios.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Jeremy Garcia por probar este protocolo y a Bhushan Kharbikar por proporcionar capacitación sobre el equipo en el UcSF Biomedical Micro and Nanotechnology Core. Esta investigación fue apoyada en parte por subvenciones del Programa de Investigación del Cáncer de Mama del Departamento de Defensa (W81XWH-10-1-1023 y W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A y 1R21CA182375-01A1), la NSF (MCB1330864) y el Centro de Construcción Celular de la UCSF (DBI-1548297), un Centro de Ciencia y Tecnología de la NSF. O.J.S fue financiado por una beca de investigación de posgrado de la NSF, una beca Siebel y una beca P.E.O. Z.J.G y A.R.A. son investigadores de Chan-Zuckerberg BioHub.

Materials

2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells Thermo Fisher Scientific 155379
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread ThorLabs SM3A1
Aldehyde Functionalized Slides Schott Nexterion Slide AL Store under dry conditions after opening.
All Plastic Syringes, 1 mL Fisher Scientific 14-817-25
Amine-Modified DNA Oligo IDT n/a See Supplemental File 1 for suggested sequences.
Aspheric Condenser Lens ThorLabs ACL7560 
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick  Chemglass CG-1906-23
Cell Culture Dishes 60×15 mm style Corning 353002
Cholesterol-Modified Oligo IDT n/a See Supplemental File 1 for suggested sequences.
Diamond Scribe Excelta 475B
DNA Oligonucleotide IDT n/a See Supplemental File 1 for suggested sequences.
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190250
Isopropyl Alcohol Sigma-Aldrich 278475
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) Fisher Scientific D37-4
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a
Microposit S1813 Positive Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel  ThorLabs SM3V10
Oven Thermo Scientific 51-028-112H
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System Plasma Etch PE-50
Photomask (custom) CAD/Art Services n/a Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns.
Razor Blades Fisher Scientific 12-640
RCT Basic Hot Plate IKA 3810001
Silicon Wafer (100 mm) University Wafer 590
Sodium Borohydride, 98%, granules Acros Organics 419471000
Spin Coater Kit Instras SCK-200 This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice.
SU-8 2075 Microchem Y111074 0500L1GL
SU-8 Developer Microchem Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow 2646340
Syringe Needles Sigma-Aldrich Z192341
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current ThorLabs LEDD1B
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane Gelest SIT8170.0
Triethylamine Sigma-Aldrich 90335
Turbo DNase Thermo Fisher Scientific AM2238
Tweezers Style N7 VWR 100488-324 The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues.
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) ThorLabs M365L2
Wafer Tweezers Agar Scientific T5063
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator Millipore Sigma W365885
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Cabral, K. A., Patterson, D. M., Scheideler, O. J., Cole, R., Abate, A. R., Schaffer, D. V., Sohn, L. L., Gartner, Z. J. Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA. J. Vis. Exp. (168), e61937, doi:10.3791/61937 (2021).
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