Entrega direta de medicamentos ao rim através da artéria renal
Summary
Este manuscrito descreve um método de entrega direcionada a um único rim através de um cateter colocado na aorta abdominal infrarenal no camundongo.
Abstract
Há necessidade de injeções direcionadas para permitir o aumento e a exposição renal específica para avaliação eficiente de alvos de drogas no campo da pesquisa renal. O acúmulo de drogas em determinados órgãos pode dar origem a efeitos adversos e indesejados, dependendo da natureza do injetor. Para minimizar o derramamento e/ou acúmulo em outros tecidos, o método descrito aqui direciona a formulação para a corrente sanguínea da artéria renal inserindo um cateter na aorta infra renal, logo abaixo de onde se ramifica na artéria renal, resultando no rim como órgão atingido pela primeira vez e distribuição da formulação em todo o rim.
Este manuscrito fornece uma descrição detalhada do método, bem como seus desafios e dificuldades. Ele orienta o experimentador a se tornar hábil com este tipo de microcirurgia que requer precisão em condições estéreis. A velocidade é crucial para minimizar a isquemia e praticar o procedimento aumentará a chance de injeções bem sucedidas sem efeitos adversos. Modulando o tempo entre injeção e reperfusão, bem como o volume injetado, o risco de derramamento para outros órgãos é mitigado.
Observe que esta técnica é adequada para estratégias de dosagem única.
Introduction
No campo de pesquisa pré-clínico dentro da indústria farmacêutica, o desenvolvimento de modelos e métodos faz parte do trabalho diário. Há um interesse crescente pela capacidade de direcionar drogas para órgãos específicos, ou mesmo separar compartimentos de um órgão, sem grande repercussão/armadilha, via corrente sanguínea, para outros tecidos. Isso permite uma exposição aumentada e específica para avaliação eficiente de metas medicamentosas em modelos de diferentes áreas da doença 1,2,3,4.
Uma forma comum de entregar substâncias é por rotas sistêmicas (por exemplo, através da veia traseira) uma vez que é menos invasiva do que o método descrito neste manuscrito. No entanto, a administração sistêmica aumenta o risco de aumento do metabolismo ou acúmulo do composto em outros tecidos além do órgão alvo pretendido, ao passar por órgãos filtrantes como o pulmão, o fígado e o baço 2,3,5. Além de não atingir o tecido destinado, isso poderia potencialmente dar origem a efeitos adversos e/ou indesejados, dependendo da natureza do injetado. Apenas moléculas muito pequenas passam os capilares dos órgãos filtrantes e, portanto, a entrega direcionada é especialmente importante se trabalhar com moléculas maiores 6.
Para minimizar o derramamento e/ou acúmulo de formulação injetada, em outros tecidos, o método descrito aqui direciona a formulação para a corrente sanguínea da artéria renal através de um cateter inserido na aorta abdominal logo abaixo de onde se ramifica na artéria renal, resultando no rim como órgão atingido pela primeira vez. Outra vantagem com esta administração guiada é que uma dose/volume mais baixo pode ser usada para atingir o mesmo nível de exposição alcançado via administração sistêmica 3.
Outras rotas de administração têm sido exploradas, por exemplo, injeções através de um cateter diretamente na artéria renal. Em nossas mãos, isso foi encontrado para apresentar um maior risco de falha em restaurar a circulação para o rim. O diâmetro muito pequeno da artéria renal (aproximadamente 0,35-0,55 mm de diâmetro) torna a incisão relativamente grande e representa um risco de obstrução e/ou embolia ao fechar o orifício de entrada. De acordo com nossa experiência, danos isquêmicos ao rim muitas vezes ocorreram ao usar este método, e, portanto, desenvolvemos essa nova maneira de atingir com sucesso o rim injetando substâncias através da incisão da aorta maior para atingir o rim.
Existem técnicas semelhantes sendo desenvolvidas em ratos que também manifestam os desafios e o risco de estenose/trombose trabalhando com injeções diretamente na artéria renal 5. Isso corrobora nossas descobertas, uma vez que os vasos em camundongos são ainda menores.
Este manuscrito e vídeo descrevem, em detalhes, como as injeções podem ser direcionadas para a artéria renal em camundongos através de um cateter inserido na aorta infrarenal, bem como orientações sobre como superar as dificuldades comuns no procedimento, para trabalhar da maneira mais segura possível e, assim, aumentar a reprodutibilidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método tem sido bem sucedido em entregar formulações ao rim sem causar danos renais. Pode ser usado para a entrega de qualquer tipo de formulação (por exemplo, pequenas moléculas, células-tronco/progenitoras ou microvesculas). O método pode ser aplicado em animais saudáveis ou em modelos de doenças renais.
Na Figura 2 e Figura 3,a histologia é apresentada. A Figura 2 mostra histologia 180 minutos após a perfusão, enquanto a Figura 3 mostra a história 7 dias após a infusão. A razão para isso é que os experimentos com artéria renal foram de apenas 180 minutos de duração. Para ter certeza de que não tivemos nenhum dano crônico com este novo método, nós propositadamente esperamos 7 dias para avaliá-los. O número n é pequeno, mas este é apenas um exemplo.
Observe que este método recém-desenvolvido de administração de aorta para atingir o rim é um método invasivo com rendimento relativamente baixo e é adequado apenas para estratégias de dosagem única. A dosagem repetida não é possível com este método.
Com pequenos ajustes das colocações de ligadura, este método poderia possivelmente ser usado para infundir ambos os rins simultaniously5,7. Com o risco aumentado de derramamento através da ramificação aórtica decidimos manter a ligadura ocluante o mais próximo possível do rim, levando a injeção apenas para o rim esquerdo. Também pode ser usado além de outros modelos ou técnicas como a não-ofefictomia ou talvez até mesmo a lesão simultânea de isperfusão renal (IRI). Em nossa opinião, fazer a injeção apenas 24 horas após a cirurgia doIRI 3 é muito duro e afetará substancialmente a recuperação do animal.
Ao usar novas cepas de camundongos, deve-se sempre realizar um experimento piloto em alguns animais dessa cepa para garantir que o método não precise ser ajustado de alguma forma. Por exemplo, em algumas cepas, o ramo de vasos da aorta pode ser posicionado um pouco diferente. A posição das ligaduras pode mudar um pouco para garantir que a formulação acabe no local certo.
desidratação
Abrir a cavidade abdominal representa um grande risco de desidratação. Por isso, é imprescindível adicionar fluidos (em torno de 37 °C) durante e após a cirurgia para garantir uma boa base para a recuperação pós-operatória. Normalmente damos 1 mL/camundongos.c. pós-cirurgia.
isquemia
Tempo de cirurgia prolongado ou se não atingir a recirculação total resultará em isquemia. É importante registrar o tempo real de isquemia e garantir que a circulação para o rim (e as pernas traseiras) sejam restauradas. Treinamento constante e refrescante de habilidades são, como sempre, importantes. Realizar o procedimento mais rapidamente reduz o tempo em que o rim é exposto à isquemia. Manter o tempo de isquemia (ligadura da aorta) para cerca de 5 min (10 min no máximo) tem sido mostrado para não prejudicar o rim.
Repercussão
Considerando o risco de derramamento para outros órgãos quando a formulação injetada está reentrando na circulação através da veia renal, o volume injetado deve ser mantido ao mínimo. Recomendamos um volume máximo de 50 μL. A dosagem também foi encontrada, por outros, como um fator crítico para a eficiência3.
Efeitos adversos (trombose e paralisia)
Inicialmente, ao configurar o modelo, experimentamos problemas não consistentes com paralisia nas pernas traseiras. Após a dose relevante de anticoagulante (10 UI de heparina na veia traseira) no pré-operatório, este efeito adverso foi significativamente diminuído. Depois de consultar especialistas na área, também começamos a ser ainda mais cuidadosos em trabalhar com cirurgias atraumáticas, o que significa não beliscar em nenhum tecido e tocar o mínimo possível de áreas. Essas ações realizadas em conjunto reduziram a frequência de paralisia de cerca de 50% para praticamente nenhuma.
Inicialmente durante o desenvolvimento do método, aplicamos tecido anticoagulante na artéria renal para fechar o orifício de incisão. Isso não foi possível ao fazer injeções na aorta, já que a pressão é muito maior na aorta. O anticoagulante também aumenta o risco de trombose se entrar no lúmen do vaso.
Certifique-se de não ter a adventitia exposta no lúmen da aorta ao suturar já que a adventitia é muito trombogênica. Evite também qualquer invertido bordas de ferida ou estreitando a aorta suturando até a coxa.
Agora temos um método estabelecido para entregar formulações diretamente ao rim.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Obrigado a René Remie na RRSSC por me ajudar a afinar a técnica e os laboratórios Instech para colaboração na produção de um cateter especial projetado. Um grande agradecimento também a todos os colegas da AstraZeneca P&D por discussões produtivas com dicas e truques, bem como xerox para completar o vídeo com som.
Materials
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
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