Прямая доставка лекарств в почки через почечную артерию
Summary
В этой рукописи описывается метод целенаправленной доставки одной почки через катетер, помещенный в инфраренальной брюшной аорты в мыши.
Abstract
Существует необходимость в направленных инъекциях для обеспечения повышенного и специфического воздействия почек для эффективной оценки целевых показателей в области исследований почек. Накопление наркотиков в некоторых органах может привести к неблагоприятным и нежелательным последствиям, в зависимости от характера инъекций. Чтобы свести к минимуму побочные эффекты и/или накопление в других тканях, описанный метод направляет формулировку в кровоток почечной артерии, вставив катетер в инфра-почечную аорту, чуть ниже, где она ветвится в почечную артерию, в результате чего почка впервые достигла органа и распределение формулировки по всей почке.
В этой рукописи содержится подробное описание метода, а также его проблемы и трудности. Он направляет экспериментатора, чтобы стать умелым с этим типом микрохирургии, которая требует точности в стерильных условиях. Скорость имеет решающее значение для минимизации ишемии и практикующих процедура увеличит вероятность успешных инъекций без побочных эффектов. Путем модулировать время между впрыском и reperfusion также, как впрыснутый том, риск переливания к другим органам смягчен.
Обратите внимание, что этот метод подходит для одной стратегии досирования.
Introduction
В области доклинических исследований в фармацевтической промышленности разработка моделей и методов является частью повседневной работы. Растет интерес к способности направлять наркотики в конкретные органы или даже отдельные отсеки органа, без серьезных побочных эффектов/захватов, через кровоток, в другие ткани. Это позволит увеличить и специфическую экспозицию для эффективной оценки целевых показателей лекарственных средств в моделях различных областейзаболеваний 1, 2,3,4.
Распространенным способом доставки веществ являются системные маршруты (например, через хвостовую вену), поскольку они менее инвазивны, чем метод, описанный в этой рукописи. Тем не менее, системное введения увеличивает риск увеличения метаболизма или накопления соединения в других тканях, чем предполагаемый целевой орган, при прохождении через фильтрующие органы, такие как легкие, печень и селезенка 2,3,5. Помимо не достигнув суждено ткани, это потенциально может привести к неблагоприятным и / или нежелательных эффектов, в зависимости от характера инъекций. Только очень маленькие молекулы проходят капилляры фильтрующих органов и поэтому целевая доставка особенно важна при работе с более крупными молекулами 6.
Чтобы свести к минимуму побочные эффекты и/или накопление инъекционной формулировки, в других тканях описанный метод направляет формулировку в кровоток почечной артерии через катетер, вставленный в брюшную аорту чуть ниже, где она ветвей в почечную артерию, в результате чего почка, как впервые достиг органа. Еще одним преимуществом этого управляемого введения является то, что более низкая доза / объем может быть использован для того, чтобы достичь того же уровня воздействия, как достигнуто с помощью системного введения 3.
Исследованы и другие маршруты введения, например, инъекции через катетер непосредственно в почечную артерию. В наших руках было установлено, что это представляет более высокий риск неспособности восстановить кровообращение в почках. Очень небольшой диаметр почечной артерии (примерно 0,35-0,55 мм в диаметре) делает разрез относительно большим и создает риск обструкции и/или эмболии при закрытии входного отверстия. Согласно нашему опыту ишемических связанных повреждение почек часто происходило при использовании этого метода, и поэтому мы разработали этот новый способ успешно целевой почки путем введения веществ через разрез больших аорты для целевой почки.
Есть аналогичные методы разрабатываются у крыс, что также проявляется проблемы и риск стеноза / тромбоза, работающих с инъекциями непосредственно в почечной артерии 5. Это подтверждает наши выводы, так как сосуды у мышей еще меньше.
Эта рукопись и видео подробно описывают, как инъекции могут быть направлены в почечную артерию у мышей через катетер, вставленный в инфраренальной аорты, а также руководство в том, как преодолеть общие трудности в процедуре, работать самым безопасным способом и тем самым увеличить воспроизводимость.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод был успешным в доставке составов в почку, не вызывая повреждения почек. Он может быть использован для доставки любых формулировок (например, небольших молекул, стволовых/прародителя клеток, или микровесяк). Метод может быть применен у здоровых животных или в моделях заболеваний почек.
На рисунке 2 и рисунке 3представлена гистология. Рисунок 2 показывает гистологию через 180 минут после перфузии, в то время как рисунок 3 показывает историю через 7 дней после инфузии. Причина этого в том, что эксперименты с почечной артерией длили всего 180 минут. Чтобы убедиться, что у нас не было хронических повреждений с этим новым методом, мы намеренно ждали 7 дней, чтобы оценить их. N-число невелико, но это всего лишь пример.
Обратите внимание, что этот недавно разработанный метод администрации аорты для целевой почки является инвазивным методом с относительно низкой пропускной способностью и подходит только для одной стратегии досирования. Повторная досирование не возможно с помощью этого метода.
При незначительных корректировках перевязочного размещения этот метод можно было бы использовать, чтобы наполнить обе почкиодновременно 5,7. С повышенным риском побочных эффектов через аорты ветвление мы решили сохранить окклюдирование лигатуры как можно ближе к почкам, как это возможно, что привело к инъекции только в левую почку. Он также может быть использован в дополнение к другим моделям или методам, как ненефэктомия или, возможно, даже одновременной почечной ишемии травмы реперфузии (IRI). На наш взгляд, делать инъекцию только через 24 часа после операции IRI3 слишком жестко и существенно повлияет на выздоровление животного.
При использовании новых штаммов мышей, всегда следует выполнить экспериментальный эксперимент на некоторых животных из этого штамма, чтобы убедиться, что метод не нуждается в корректировке в некотором роде. Например, в некоторых штаммах сосуд-ветвь от аорты может быть расположен немного иначе. Положение лигатур может несколько измениться, чтобы убедиться, что формулировка попадает в нужное место.
обезвоживание
Открытие брюшной полости представляет большой риск обезвоживания. Поэтому крайне важно добавлять жидкости (около 37 градусов по Цельсию) как во время, так и после операции, чтобы обеспечить хорошую основу для восстановления после оперативно. Мы обычно даем 1 мл / мыши s.c. после операции.
ишемия
Длительное время операции или если не достичь полной рециркуляции приведет к ишемии. Важно зафиксировать фактическое время ишемии и убедиться, что кровообращение почек (и задних ног) восстанавливаются. Постоянное обучение и обновление навыков, как всегда, важны. Выполнение процедуры быстрее сокращает время воздействия ишемии на почки. Сохранение времени ишемии (перевязка аорты) около 5 мин (10 мин макс) было показано, не повредить почку.
Разлив
Учитывая риск распространения на другие органы при повторном вводе инъекционной формулировки через почечную вену, инъекционный объем следует сведен к минимуму. Мы рекомендуем максимальный объем 50 йл Дозировка также было установлено, другими, чтобы быть критическим фактором для эффективности3.
Неблагоприятные эффекты (тромбоз и паралич)
Первоначально при настройке модели мы испытывали несопоследовательных проблем с параличом в задних ногах. После предварительной дозы антикоагулянта (10 МЕ гепарина в хвостовой вене) этот побочный эффект был значительно снижен. После консультаций с экспертами в этой области, мы также начали быть еще более осторожными в работе с атрауматической хирургии, то есть не щипать в любых тканях и касаясь как можно меньше областей, как это возможно. Эти действия вместе сократили частоту паралича примерно с 50% до практически ни одного.
Первоначально во время разработки метода, мы применили антикоагулянт ткани на почечной артерии, чтобы закрыть отверстие разреза. Это было невозможно при выполнении инъекций в аорту, так как давление намного выше в аорте. Антикоагулянт также увеличивает риск тромбоза, если он попадает в люмен сосуда.
Убедитесь, что не иметь adventitia подвергаются в люмен аорты при забое с adventitia очень тромбогенным. Также избегайте инвертирования края раны или сужения аорты, засовывав на бедро.
Теперь у нас есть установленный метод доставки составов непосредственно в почку.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодаря Рене Реми в RRSSC за помощь мне тонкой техники и Instech лабораторий для сотрудничества в производстве специального разработанного катетера. Большое спасибо также всем коллегам в АстраЗенека НИОКР для продуктивных дискуссий с советами и приемами, а также Xerox для завершения видео со звуком.
Materials
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
