מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.
Abstract
מבחנים שפורסמו עבור nociception מכני ב Drosophila הובילו הערכות משתנות של התנהגות. כאן, אנחנו מפוברק, לשימוש עם זחלים Drosophila, מותאם אישית ניקל טיטניום סגסוגת (ניטינול) חוטים. בדיקות מכאניות אלה דומות לסיבים של פון פריי המשמשים בעלי חוליות למדידת תפיסה מכנית. כאן, אנו מדגימים כיצד להפוך ולכייל בדיקות מכניות אלה וכיצד ליצור מינון התנהגותי מלא-תגובה מ subthreshold (טווח מזיק או רעיל) כדי suprathreshold (טווח רעיל נמוך עד גבוה) גירויים. כדי להדגים את התועלת של הבדיקות, חקרנו רגישות יתר הנגרמת על ידי נזק לרקמות בזחלי דרוזופילה. אלודיניה מכנית (רגישות יתר לגירוי מכני בלתי מזיק בדרך כלל) והיפרלגזיה (היענות מוגזמת לגירוי מכני רעיל) עדיין לא הוקמו בזחלים דרוזופילה. באמצעות בדיקות מכניות כי הם בדרך כלל מזיקים או בדיקות כי בדרך כלל לעורר התנהגות מרתיעה, מצאנו כי זחלים Drosophila לפתח רגישות יתר מכנית (הן allodynia ו hyperalgesia) לאחר נזק לרקמות. לפיכך, הבדיקות המכניות והבדיקות שאנו ממחישים כאן יהיו ככל הנראה כלים חשובים לנתח את המנגנונים המולקולריים/גנטיים הבסיסיים של רגישות יתר מכנית.
Introduction
זחלי דרוזופילה מפגינים התנהגות מתגלגלת מרתיעה אופיינית כאשר נחשפים לגירויים רעילים שונים: תרמי1, מכני2, וכימיקל3. התנהגות זו נבדלת בבירור מתנועה רגילה. כאן אנו מתארים מבחנים מכניים משופרים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך nociception מכני ורגישות מכנית.
במחקר שנערך לאחרונה, המצאנו חוטים דמויי פון פריי באמצעות חוטי ניטינול4. בדיקות המפעילות כוחות ולחצים שונים נעשו על ידי שינוי האורכים והקוטרים של חוטי הניטינול היוצרים כל גשוש. בדיקות מכניות כוילו וערכי הכוח הנמדדים (במילינוטון, mN) הוסבו ללחץ (קילופסקל, kPa), בהתבסס על אזור הקצה של כל בדיקה4. ייצור מותאם אישית של בדיקות מכניות מותר לנו ליצור subthreshold (≤200 kPa) כדי suprathreshold (225 kPa כדי 5318 kPa) לחצים, אשר יכול, באופן עקרוני, להיות מועיל לחקר רגישות יתר מכנית. באמצעות חוטים אלה פון פריי מכני משופר, הראינו כי לחץ4, בניגוד לכוח נבדק בעבר2,5,6 בקורלציה עקבית יותר עם היענות התנהגותית מרתיעה בזחלים Drosophila. בדיקה מכנית משופרת המתוארת כאן גם עזר לזהות גורם גדילה אנדותל כלי דם שמורות (VEGF) הקשורות קולטן טירוסין קינאז איתות מסלול המסדיר nociception מכני זבובים וחולדות4.
אלודיניה מכנית והיפרלגזיה, שתי אופנים של רגישות יתר, הם understudied יחסית בזחלים Drosophila, לעומת תרמית (חום וקור) ואמצעים חושיים כימיים3,7,8,9,10. זה כנראה בשל היעדר בדיקות מכניות ספציפיות המשתרעות מגירויים מזיקים לטווח רעיל גבוה2,5,6. גירוי בלתי מזיק בדרך כלל המעורר את התנהגות מתגלגל מרתיע טיפוסי לאחר זחלים Drosophila לחוות נזק לרקמות3,7 נקרא allodynia. תגובה מתגלגלת מוגזמת לגירוי רעיל בדרך כלל ידועה בשם hyperalgesia7. גירויים רעילים מוגדרים ככאלה שמעוררים נזק לרקמות ויכולים להפעיל nociceptors11. גירויים רעילים המועברים לזחלי דרוזופילה פוגעים באפידרמיס המחסום, בנוירונים החושיים ההיקפיים3,4,7, או שניהם.
במאמר זה, אנו מדגימים כיצד לפברק ולכייל בהתאמה אישית בדיקות מכניות דמויי פון פריי המתאימות לזחלים של דרוזופילה. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בבדיקות אלה כדי לבדוק תגובות נוציפציביות מכניות בזחלי דרוזופילה. לבסוף, אנו מדגימים עוד יותר את התועלת של בדיקות אלה באמצעות אותם כדי להדגים את נוכחותם של רגישות יתר מכנית, הן allodynia והן hyperalgesia, בעקבות נזק לרקמות בזחלים Drosophila (ראה תוצאות מייצגות).
Protocol
Representative Results
Discussion
שינינו בדיקה מכנית הוקמה1,2,16 באמצעות בדיקות מכניות מותאמות אישית מפוברק חוטי ניטינול. סגסוגת מתכת זו מאפשרת לנו להשתמש חוטים בקוטר קטן יותר המתאימים לגודל של זחלי Drosophila. מונופילמנטים מבוססי קו דיג שלטו בתחום nociception מכני לטוס עד כה2,5,6,16. חוטי הניטינול שלנו שומרים על צורתם ומדדו לחץ במשך כ -3-5 חודשים (מניסיוננו). על ידי שינוי האורך והקוטר של חוטי הניטינול, המשתמש יכול ליצור מגוון רחב של לחצים המשתרעים מתת-כותרת לתגובה מתגלגלת כמעט מלאה. בפרט, ביצוע בדיקות subthreshold הוא פשוט יותר עם חוטי ניטינול בקוטר קטן יותר. באמצעות בדיקות אלה, מצאנו כי לחץ, ולא כוח, מעורר תגובות התנהגותיות nocifensive עקבי יותר4. אנו מדגימים כאן, באמצעות מודל רגישות nociceptive UV-induced מבוסס היטב7,10,13, כי חוטים אלה הם גם כלי שימושי לחקר רגישות יתר מכנית – allodynia ו hyperalgesia.
מחקרים קודמים באמצעות בדיקות מכניות מפוברק מקו דיג הובילו שונות מסוימת בתגובה התנהגותית2,6,16,17. מספר גורמים עשויים להסביר זאת. ראשית, מכיוון שהלחץ הוא המשתנה החשוב, ההבעה של קצה הסיב כך שהוא מעוגל ואין לו קצוות חדים היא קריטית. שנית, דיווח על ערכי לחץ ולא רק כוח חשוב לשחזור הניסויים, מכיוון שבדיקות מכניות שונות המייצרות כוחות דומים יכולות לעורר לחצים שונים4. שלישית, חיוני ליישם רק גירוי מכני אחד לכל זחל באמצעות בדיקות רעילות, מכיוון שבדיקות כאלה מייצרות נזק לרקמות תלויות מינון ברמות האפידרמיס4 והנוירונים החושיים (איור 2E). גירוי מכני רעיל שני או עוקב, לאחר נזק לרקמות כבר המושרה, יכול לפגוע בתפקוד של נוירונים חושיים היקפיים מושפעים לעורר תגובה התנהגותית שונה. במחקר אחר, זחלים מגורה פעמיים עם בדיקות מכניות רעילות הציגו בעיקר תגובה התנהגותיתמשופרת 5, מה שמרמז על התפתחות של רגישות מכנית חריפה (hyperalgesia), אשר עשוי לנבוע נזק לרקמות עורר על ידי הגירוי המכני המזיק הראשון. לעומת זאת, מחברים אחרים 6 דיווחו עלתגובה התנהגותית מעורבת (מוגברת או מופחתת), המצביעה על כך שהתגובה ההתנהגותית שהשתנתה יכולה להיות בגלל נזק/תפקוד לקוי של הרקמה העצבית. גירוי כל זחל רק פעם אחת מבטל שונות אפשרית בתגובות התנהגותיות הנובעות רגישות או נזק לרקמות. רביעית, אנו מגרים מכנית קטע A8, שהוא אחורי יותר מאשר מחקרים קודמים (אזורים מועדפים A3-A4)2,5,16. בדיקות בין ~ 3,900 kPa ו 5,300 kPa להחיל על כל קטע A2 או A8 לא הראה שום הבדלים התנהגותיים4. בנוסף, A8, לעומת A2-A4, קל יותר לעורר עם בדיקות מכניות המייצרות לחצים נמוכים יותר (<300 kPa) כי הזחל הוא דק יותר באזור זה ולכן בקלות רבה יותר דחוס. מחקרים אחרים הראו כי גירוי מכני רעיל של הקצה האחורי של הזחל (מועבר על ידי סיכת חרקים נוקשה, מוחזק עם מלקחיים) עורר בעיקר קטר קדמי, ולא תגובה מרתיעה או מתגלגלת18. תגובה התנהגותית שונה זו יכולה להיות בשל הבדלים במאפיינים של החומרים המשומשים (חוטי ניטינול ניתנים לכיפוף לעומת סיכת חרקים בלתי דחוסה) או ללחצים שונים המועברים לזחלים (ערך הלחץ של סיכת החרקים לא דווח).
הפיתוח של מבחני nociception מכני עבור זחלים Drosophila אפשרה לשדה לגלות כי ערוצי יון חושיים מכניים שונים ומעגלים עצביים לתווך nociception מכני5,6,16,17. עם זאת, המחקר של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) פיגר, לעומת רגישות של אופני החושים האחרים – חום7, 8,10,13,14, קר9, ו כימי3. השהיה זו עשויה לנבוע בחלקה מהיעדר בדיקות מכאניות מתאימות שיכולות ליצור טווח תגובה מלא המשתרע על פני תת-אחיזה ללחצים suprathreshold. חשיבות מיוחדת, במיוחד להערכת allodynia מכני, הם בדיקות subthreshold שאינם מעוררים תגובה מתגלגלת מרתיעה מזחלים לא נפגעים. המשמעות של הבדיקות המכניות המשופרות שלנו היא שניתן לפברק אותן כדי להתפרס על פני גירויים בלתי מזיקים (subthreshold ~ 174 kPa–200 kPa) או את הטווח הנמוך עד רעיל גבוה (suprathreshold ~ 225 kPa כדי ~ 5,116 kPa). כאן, אנו מדגימים באמצעות חוטים דמויי nitinol פון פריי כי זחלים Drosophila לפתח הן allodynia מכני היפרלגזיה מכני לאחר הקרנת UV. הרגישות המכנית מראה כמה הבדלים בהשוואה לרגישות תרמית. הן תחילתה והן שיא הרגישות המכנית מוקדם יותר (~ 4 שעות) בהשוואה לרגישות תרמית (חום) (~ 8 שעות להיפרלגזיה ו ~ 24 שעות לאגודיניה)7. בנוסף, allodynia מכני hyperalgesia הם בו זמנית (שניהם שיא ב ~ 4 שעות). יתר על כן, בעוד רגישות חום (allodynia ו hyperalgesia) פותר לחלוטין בנקודות זמן מאוחר יותר7, רגישות יתר מכנית הציג זנב ארוך שנשאר מעט מעל קו הבסיס. רגישות קרה בדרוזופילה כרוכה במתג בהתנהגויות מעוררות קור 9 ובהופעתן שלהתנהגויות חדשות מעוררות קור – תופעה שאינה נצפית בגירוי מכני. הבדלים אלה בהתנהגויות התפרצות, משך זמן ונצפות מצביעים על כך שכל שיטה חושית עשויה להיות נשלטת על ידי מסלולי איתות שונים. שילוב מבחני הרגישות המתוארים כאן עם הכלים הגנטיים החזקים הזמינים בדרוסופילה אמור לאפשר ניתוח גנטי מדויק של רגישות יתר מכנית (allodynia ו hyperalgesia) שנצפו.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לתומס וואנג על פיתוח אב הטיפוס פון פריי, פטריק ג’יי הואנג על שיפור הבדיקה המכנית, מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה על השליטה (w1118) ו- ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP טסים, וחברי מעבדת גלקו על קריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי R21NS087360 ו R35GM126929 ל MJG.
Materials
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
