Een verbeterde test en tools voor het meten van mechanische nociceptie in Drosophila-larven
Summary
Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe een verbeterde test voor mechanische nociceptie in Drosophila-larven kan worden uitgevoerd. We gebruiken de test hier om aan te tonen dat mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) bestaat in Drosophila-larven.
Abstract
Gepubliceerde tests voor mechanische nociceptie in Drosophila hebben geleid tot variabele beoordelingen van gedrag. Hier fabriceerden we, voor gebruik met Drosophila-larven, aangepaste metalen nikkel-titaniumlegering (nitinol) filamenten. Deze mechanische sondes zijn vergelijkbaar met de von Frey filamenten die in gewervelde dieren worden gebruikt om mechanische nociceptie te meten. Hier laten we zien hoe we deze mechanische sondes kunnen maken en kalibreren en hoe we een volledige gedragsdosis-respons kunnen genereren van subthreshold (onschadelijk of niet-schadelijk bereik) tot suprathreshold (laag tot hoog schadelijk bereik) stimuli. Om het nut van de sondes aan te tonen, onderzochten we weefselschade-geïnduceerde overgevoeligheid bij Drosophila-larven. Mechanische allodynie (overgevoeligheid voor een normaal onschadelijke mechanische stimulus) en hyperalgesie (overdreven reactievermogen op een schadelijke mechanische stimulus) zijn nog niet vastgesteld in Drosophila-larven. Met behulp van mechanische sondes die normaal onschadelijk zijn of sondes die meestal een aversief gedrag uitlokken, ontdekten we dat Drosophila-larven mechanische overgevoeligheid (zowel allodynie als hyperalgesie) ontwikkelen na weefselschade. De mechanische sondes en tests die we hier illustreren, zullen dus waarschijnlijk belangrijke instrumenten zijn om de fundamentele moleculaire / genetische mechanismen van mechanische overgevoeligheid te ontleden.
Introduction
Drosophila-larven vertonen een karakteristiek aversief rolgedrag wanneer ze worden blootgesteld aan verschillende schadelijke stimuli: thermisch1, mechanisch2en chemisch3. Dit gedrag onderscheidt zich duidelijk van normale voortbeweging. Hier beschrijven we een verbeterde mechanische test die kan worden gebruikt om mechanische nociceptie en mechanische sensibilisatie te beoordelen.
In een recente studie hebben we von Frey-achtige filamenten vervaardigd met nitinoldraden4. Sondes die verschillende krachten en drukken uitoefenden, werden gemaakt door de lengtes en diameters van de nitinoldraden die elke sonde vormen te variëren. Mechanische sondes werden gekalibreerd en de gemeten krachtwaarden (in millinewton, mN) werden omgezet in druk (kilopascal, kPa), op basis van het tipgebied van elke sonde4. Aangepaste fabricage van mechanische sondes stelde ons in staat om subthreshold (≤200 kPa) tot suprathreshold (225 kPa tot 5318 kPa) drukken te genereren, wat in principe gunstig zou kunnen zijn voor het bestuderen van mechanische overgevoeligheid. Met behulp van deze verbeterde mechanische von Frey-achtige filamenten toonden we aan dat druk4, in tegenstelling tot de eerder onderzochte kracht2,5,6 consistenter correleert met aversieve gedragsresponsiviteit in Drosophila-larven. De verbeterde mechanische test die hier wordt beschreven, hielp ook bij het identificeren van een geconserveerde Vasculaire Endotheliale Groeifactor (VEGF)-gerelateerde receptor tyrosinekinase die een pad signaleert dat mechanische nociceptie bij vliegen en rattenreguleert 4.
Mechanische allodynie en hyperalgesie, twee modaliteiten van overgevoeligheid, zijn relatief onderbelicht in Drosophila-larven, vergeleken met de thermische (warmte en koude) en chemische sensorische modaliteiten3,7,8,9,10. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het gebrek aan specifieke mechanische sondes die zich uitstrekken van onschadelijke stimuli tot het hoge schadelijke bereik2,5,6. Een normaal onschadelijke stimulus die het typische aversieve rolgedrag uitlokt nadat Drosophila-larven weefselschadeervaren 3,7 wordt allodynie genoemd. Een overdreven rollende reactie op een typisch schadelijke stimulus staat bekend als hyperalgesie7. Schadelijke stimuli worden gedefinieerd als stimuli die weefselschade veroorzaken en nociceptoren kunnen activeren11. Schadelijke stimuli die aan Drosophila-larven worden geleverd, beschadigen ofwel de barrière-epidermis, de perifere nociceptieve sensorische neuronen3,4,7of beide.
In dit artikel laten we zien hoe we von Frey-achtige mechanische sondes op maat kunnen fabriceren en kalibreren die geschikt zijn voor Drosophila-larven. Verder laten we zien hoe we deze sondes kunnen gebruiken om mechanische nociceptieve reacties in Drosophila-larven te testen. Ten slotte demonstreren we verder het nut van deze sondes door ze te gebruiken om de aanwezigheid van mechanische overgevoeligheid aan te tonen, zowel allodynie als hyperalgesie, na weefselschade bij Drosophila-larven (zie representatieve resultaten).
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een gevestigde mechanische test1,2,16 gewijzigd met behulp van aangepaste mechanische sondes vervaardigd uit nitinolfilamenten. Deze metaallegering stelt ons in staat om filamenten met een kleinere diameter te gebruiken die geschikt zijn voor de grootte van de Drosophila-larven. Monofilamenten op basis van vislijns hebben tot op heden het gebied van de mechanische vlieg nociceptie gedomineerd2,5,6,16. Onze nitinol filamenten behouden hun vorm en gemeten druk gedurende ongeveer ~ 3-5 maanden (in onze ervaring). Door de lengte en diameter van de nitinolfilamenten te variëren, kan de gebruiker een breed scala aan drukken genereren, variërend van subthreshold tot een bijna volledige rolrespons. Met name het maken van subthreshold-sondes is eenvoudiger met de nitinolfilamenten met een kleinere diameter. Met behulp van deze sondes ontdekten we dat druk, in plaats van kracht, consistentere nocifensieve gedragsreactiesoproept 4. We laten hier met behulp van een gevestigde UV-geïnduceerde nociceptieve sensibilisatiemodel7,10,13zien dat deze filamenten ook een nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van mechanische overgevoeligheid – allodynie en hyperalgesie.
Eerdere studies met behulp van mechanische sondes vervaardigd uit de vislijn hebben geleid tot een zekere variabiliteit in gedragsresponsiviteit2,6,16,17. Verschillende factoren kunnen hier rekening mee houden. Ten eerste, omdat druk de belangrijke variabele is, is het polijsten van de filamenttip zodat deze afgerond is en geen scherpe randen heeft, van cruciaal belang. Ten tweede is het rapporteren van drukwaarden in plaats van alleen kracht belangrijk voor de reproduceerbaarheid van de experimenten, omdat verschillende mechanische sondes die vergelijkbare krachten genereren ongelijksoortige drukken kunnen uitlokken4. Ten derde is het van cruciaal belang om slechts één mechanische stimulatie per larve toe te passen met behulp van schadelijke sondes, omdat dergelijke sondes een dosisafhankelijke weefselschade veroorzaken bij de epidermale4 en sensorische neuronale niveaus(figuur 2E). Een tweede of daaropvolgende schadelijke mechanische stimulus, nadat weefselschade is geïnduceerd, kan de functie van de aangetaste perifere sensorische neuronen mogelijk aantasten en een veranderde gedragsrespons uitlokken. In een andere studie vertoonden larven die tweemaal werden gestimuleerd met schadelijke mechanische sondes meestal een verbeterde gedragsrespons5, wat wijst op de ontwikkeling van een acute mechanische sensibilisatie (hyperalgesie), die het gevolg zou kunnen zijn van de weefselschade veroorzaakt door de eerste schadelijke mechanische stimulus. Omgekeerd rapporteerden andere auteurs6 een gemengde (verhoogde of verminderde) gedragsrespons, wat erop wijst dat de veranderde gedragsrespons te wijten kan zijn aan schade / disfunctie van het neuronale weefsel. Het slechts één keer stimuleren van elke larve elimineert mogelijke variatie in gedragsreacties als gevolg van sensibilisatie of weefselschade. Ten vierde hebben we segment A8 mechanisch gestimuleerd, wat posterieurer is dan eerdere studies (voorkeursgebieden A3-A4)2,5,16. Sondes tussen ~3.900 kPa en 5.300 kPa toegepast op segment A2 of A8 lieten geen gedragsverschillenzien 4. Bovendien is A8, in vergelijking met A2-A4, gemakkelijker te stimuleren met mechanische sondes die lagere drukken genereren (<300 kPa) omdat de larve dunner is in dit gebied en dus gemakkelijker kan worden samengeperst. Andere studies toonden aan dat schadelijke mechanische stimulatie van het achterste uiteinde van de larve (geleverd door een stijve insectenspeld, vastgehouden met een tang) meestal voorwaartse voortbeweging opriep, in plaats van een aversieve of rollende respons18. Deze verschillende gedragsrespons kan te wijten zijn aan verschillen in de eigenschappen van de gebruikte materialen (buigbaar nitinolfilament versus onbedrukbare insectenspeld) of aan verschillende druk die aan de larven wordt geleverd (de drukwaarde van de insectenspeld werd niet gerapporteerd).
De ontwikkeling van een mechanische nociceptietest voor Drosophila-larven heeft het veld in staat gesteld te ontdekken dat verschillende mechanische sensorische ionkanalen en neurale circuits mechanische nociceptiebemiddelen 5,6,16,17. De studie van de mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) is echter achtergebleven, vergeleken met de sensibilisatie van de andere zintuiglijke modaliteiten — warmte7,8,10,13,14, koud9en chemisch3. Deze vertraging kan deels te wijten zijn aan de afwezigheid van geschikte mechanische sondes die een volledig responsbereik kunnen genereren dat subthreshold tot suprathreshold-drukken omvat. Van bijzonder belang, vooral voor het beoordelen van mechanische allodynie, zijn subthreshold-sondes die geen aversieve rollende reactie van niet-gewonde larven uitlokken. Het belang van onze verbeterde mechanische sondes is dat ze kunnen worden vervaardigd om onschadelijke stimuli (subthreshold ~ 174 kPa – 200 kPa) of het lage tot hoge schadelijke bereik (suprathreshold ~ 225 kPa tot ~ 5.116 kPa) te overspannen. Hier demonstreren we met behulp van de nitinol von Frey-achtige filamenten dat Drosophila-larven zowel mechanische allodynie als mechanische hyperalgesie ontwikkelen na UV-bestraling. De mechanische sensibilisatie vertoont enkele verschillen in vergelijking met thermische sensibilisatie. Zowel het begin als de piek van mechanische sensibilisatie is eerder (~ 4 uur) in vergelijking met thermische (warmte) sensibilisatie (~ 8 uur voor hyperalgesie en ~ 24 uur voor allodynie)7. Bovendien zijn de mechanische allodynie en hyperalgesie gelijktijdig (beide pieken bij ~ 4 uur). Bovendien, terwijl warmtesensibilisatie (allodynie en hyperalgesie) op latere tijdstippen7volledig verdwijnt, vertoonde mechanische overgevoeligheid een lange staart die iets boven de uitgangswaarde bleef. Koudesensibilisatie in Drosophila omvat een schakelaar in koud opgeroepen gedrag9 en de opkomst van nieuw koud opgeroepen gedrag – een fenomeen dat niet wordt waargenomen met mechanische stimulatie. Deze verschillen in begin, duur en waargenomen gedrag suggereren dat elke zintuiglijke modaliteit kan worden bestuurd door verschillende signaleringsroutes. Het combineren van de hier beschreven sensibilisatietest met de krachtige genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila zou een nauwkeurige genetische dissectie van de waargenomen mechanische overgevoeligheid (allodynie en hyperalgesie) mogelijk moeten maken.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Thomas Wang voor de ontwikkeling van het prototype von Frey filamenten, Patrick J. Huang voor het verbeteren van de mechanische sondetest, het Bloomington Drosophila Stock Center voor de besturing (w1118) en ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP vliegvoorraden, en Galko lableden voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door R21NS087360 en R35GM126929 aan MJG.
Materials
| Beaker | Fisher Scientific | 02-540C | Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do. |
| Black (Arkansas) bench stone | Dan’s Whetstone | SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C | Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/ |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | Any equivalent confocal microscope will do |
| Coplin Jar | Fisher Scientific | 08-816 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816 |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | For anesthetizing larvae. |
| Etherization chamber | This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape. | ||
| Fiber Optic Light Guide | Schott AG | A08575 | Schott Dual Gooseneck 23 inch |
| Forceps | Fine Science Tool | FS-1670 | For transferring larvae |
| Glue | Aleene's | N/A | Aleene's® Wood Glue, formerly called (Aleene's All-Purpose Wood Glue) https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue |
| Graspable holder | Loew Cornell | N/A | Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces. |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ML | |
| Hypodermic needle 30G 1/2"L | Fisher Scientific | NC1471286 | BD Precisionglide® syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires |
| Large Petridish | Falcon | 351007 | 60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Microscope (Zeiss) Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do |
| Microscope Cover Glass 22×22 | Fisher | 12-545-B | |
| Microscope Cover Glass 22×40 | Corning | 2980-224 | Tickness 1 1/2 |
| Microscope Slides | Globe Scientific Inc. | 1358Y | |
| Mini Diagonal Cutter | Fisher Scientific | S43981 | For cutting nitinol filaments |
| Nitinol filaments, Diameters: 0.004”, 0.006”, 0.008” | Mailin Co | N/A | Fifteen pieces of each diameter of 12” length were ordered. https://malinco.com/ |
| Piece of black vinyl | Office Depot | N/A | We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva |
| Small Petridish | Falcon | 351008 | 35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish |
| Wipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture. |
| W1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 3605 | Control strain for behavioral assays |
| ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 8749 | Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons |
References
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. Painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).
- Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. J. An assay for chemical nociception in Drosophila larvae. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 374 (1785), 20190282 (2019).
- Lopez-Bellido, R., et al. Growth factor signaling regulates mechanical nociception in flies and vertebrates. Journal of Neuroscience. 39 (30), 6012-6030 (2019).
- Hu, C., et al. Sensory integration and neuromodulatory feedback facilitate Drosophila mechanonociceptive behavior. Nature Neuroscience. 20 (8), 1085-1095 (2017).
- Kim, S. E., Coste, B., Chadha, A., Cook, B., Patapoutian, A. The role of Drosophila Piezo in mechanical nociception. Nature. 483 (7388), 209-212 (2012).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (10), 799-806 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Current Biology. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Turner, H. N., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Injury-induced cold sensitization in Drosophila larvae involves behavioral shifts that require the TRP channel Brv1. PloS One. 13 (12), 0209577 (2018).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. eLife. 4, 10735 (2015).
- Cervero, F., Merskey, H. What is a noxious stimulus. Pain Forum. 5 (3), 157-161 (1996).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3837 (2012).
- Follansbee, T. L., et al. Drosophila nociceptive sensitization requires BMP signaling via the canonical SMAD pathway. Journal of Neuroscience. 37 (35), 8524-8533 (2017).
- Im, S. H., Patel, A. A., Cox, D. N., Galko, M. J. Drosophila insulin receptor regulates the persistence of injury-induced nociceptive sensitization. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), (2018).
- Jo, J., et al. Drosophila caspase activity is required independently of apoptosis to produce active TNF/Eiger during nociceptive sensitization. Cell Death & Disease. 8 (5), 2786 (2017).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Current Biology. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Guo, Y., Wang, Y., Wang, Q., Wang, Z. The role of PPK26 in Drosophila larval mechanical nociception. Cell Reports. 9 (4), 1183-1190 (2014).
- Takagi, S., et al. Divergent connectivity of homologous command-like neurons mediates segment-specific touch responses in Drosophila. Neuron. 96 (6), 1373-1387 (2017).
