La cristallografia delle proteine neutroniche è una tecnica strutturale che consente la localizzazione di atomi di idrogeno, fornendo così importanti dettagli meccanicistici della funzione proteica. Presentiamo qui il flusso di lavoro per il montaggio di un cristallo proteico, la raccolta dei dati di diffrazione neutronica, il perfezionamento della struttura e l’analisi delle mappe di densità della lunghezza dello scattering neutronico.
La cristallografia a neutroni è una tecnica strutturale che consente di determinare le posizioni degli atomi di idrogeno all’interno di macromolecole biologiche, fornendo informazioni meccanicamente importanti sugli stati di protonazione e idratazione senza indurre danni da radiazioni. La diffrazione a raggi X, al contrario, fornisce solo informazioni limitate sulla posizione degli atomi di luce e il fascio di raggi X induce rapidamente danni da radiazioni di cofattori fotosensibili e centri metallici. Qui è presentato il flusso di lavoro impiegato per le beamline IMAGINE e MaNDi presso l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL) per ottenere una struttura di diffrazione neutronica una volta che un cristallo proteico di dimensioni adeguate (> 0,1 mm3) è stato coltivato. Dimostriamo il montaggio di cristalli proteici idrogenati in capillari di quarzo per la raccolta di dati di diffrazione neutronica. Viene inoltre presentato il processo di scambio di vapore dei cristalli montati con tampone contenente D2O per garantire la sostituzione degli atomi di idrogeno nei siti scambiabili con il deuterio. L’incorporazione del deuterio riduce lo sfondo derivante dalla dispersione incoerente degli atomi di idrogeno e impedisce la cancellazione della densità causata dalla loro lunghezza di diffusione coerente negativa. Le strategie di allineamento dei campioni e di raccolta dei dati sulla temperatura ambiente sono illustrate utilizzando la raccolta di dati quasi-Laue presso IMAGINE presso il reattore isotopico ad alto flusso (HFIR). Inoltre, il montaggio di cristalli e il congelamento rapido in azoto liquido per la raccolta di crio-dati per intrappolare intermedi di reazione labile sono dimostrati presso lo strumento MaNDi time-of-flight presso la Spallation Neutron Source (SNS). Verrà inoltre affrontata la preparazione dei file di dati di coordinate e diffrazione del modello e la visualizzazione delle mappe di densità della lunghezza di diffusione dei neutroni (SLD). Infine verrà discusso il raffinamento della struttura contro i soli dati dei neutroni o contro i dati congiunti a raggi X/neutroni per ottenere una struttura a tutti gli atomi della proteina di interesse. Il processo di determinazione di una struttura neutronica sarà dimostrato utilizzando cristalli della polisaccaride litica monoossigenasi Neurospora crassa LPMO9D, una metalloproteina contenente rame coinvolta nella degradazione dei polisaccaridi recalcitranti tramite scissione ossidativa del legame glicosidico.
La cristallografia macromolecolare a neutroni è una tecnica che fornisce una finestra unica sulla struttura e sulla chimica sottostante delle proteine. Concettualmente simile alla diffrazione a raggi X, la diffrazione neutronica fornisce dettagli atomistici della struttura macromolecolare, tuttavia, l’interazione dei neutroni con i nuclei consente la localizzazione degli atomi di luce, spesso difficili da rilevare con la diffrazione a raggi X1. Durante la diffrazione dei raggi X, i raggi X si diffondono dalla nube di elettroni, rendendo gli atomi di luce come l’idrogeno (H) scarsamente visibili nelle mappe di densità elettronica che non hanno una risoluzione vicina a quella sub-Ångström2. Al contrario, l’intensità di scattering dei neutroni dipende da interazioni complesse con il nucleo, con isotopi dello stesso elemento che mostrano lunghezze di scattering diverse. Pertanto, gli atomi leggeri e i loro isotopi, come l’idrogeno (1H) e il deuterio (2H o D), hanno una visibilità paragonabile agli atomi di carbonio, azoto e ossigeno nella mappa della densità di lunghezza di diffusione dei neutroni (SLD). Inoltre, poiché la grandezza dello scattering neutronico è indipendente dal numero di elettroni, la dispersione dagli elementi leggeri non è oscurata da elementi pesanti quando sono in prossimità l’uno dell’altro, come si osserva nello scattering a raggi X. La maggiore visibilità di H e del suo isotopo D quando si impiega la diffrazione neutronica fornisce preziose informazioni sullo stato di protonazione di residui, cofattori e ligandi cataliticamente importanti e aiuta l’orientamento delle molecole d’acqua, rivelando importanti informazioni sui meccanismi catalitici e sulla chimica delle proteine3. La diffrazione neutronica offre anche il vantaggio di essere una tecnica non distruttiva, particolarmente adatta a campioni biologici sensibili alla ionizzazione come proteine con centri metallici o cofattori redox fotosensibili2. L’obiettivo principale di questo articolo è fornire una panoramica del flusso di lavoro per ottenere una struttura cristallina della proteina neutronica di alta qualità. Rimandiamo il lettore interessato a Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 e O’Dell et al.3 per un’eccellente panoramica della diffrazione delle proteine neutroniche e Ashkar et al.7 per ulteriori applicazioni dello scattering neutronico.
I neutroni sono generati principalmente durante le reazioni nucleari impiegando uno dei due processi: fissione nucleare alle sorgenti del reattore o spallazione a fonti basate su acceleratori8. Le sorgenti di reattori forniscono un fascio di neutroni continuo impiegando la fissione nucleare dell’isotopo 235U mentre le sorgenti di neutroni di spallazione producono un fascio di neutroni pulsati bombardando un bersaglio, ad esempio un metallo liquido come il mercurio, con protoni9. L’Oak Ridge National Laboratory (ORNL) di Oak Ridge, Tennessee, ospita sia una sorgente di neutroni allo stato stazionario presso l’High Flux Isotope Reactor (HFIR) che una sorgente pulsata a 60 Hz presso la Spallation Neutron Source (SNS). La beamline IMAGINE, situata presso l’HFIR, è un diffrattometro a neutroni ottimizzato per macromolecole biologiche (Figura supplementare 1)10. IMAGINE impiega un rivelatore di piastre di immagine neutronica per misurare i dati quasi-Laue utilizzando una passa di banda stretta nell’intervallo di 2,8 – 4,5 Å da cristalli singoli con bordi di cella unitari < 150 Å. Il Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), situato presso l'SNS, è un diffrattometro a neutroni Laue a tempo di volo (TOF) dotato di un daf (sferical detector array frame) (Figura supplementare 2)11. MaNDi misura i dati provenienti da singoli cristalli con bordi di celle unitarie nell’intervallo 10 – 300 Å impiegando una larghezza di banda sintonizzabile a 2 Å-lunghezza d’onda compresa tra 2,0 e 6,0 Å12.
Il processo di generazione dei neutroni è ad alta intensità energetica, con conseguenti flussi di fascio di neutroni relativamente deboli quando confrontati con i flussi di fasci di raggi X a sorgenti di sincrotrone13. Per garantire un rapporto segnale-rumore sufficiente durante la raccolta dei dati, è necessario coltivare cristalli di dimensioni e qualità adeguate14. Tipicamente, i cristalli con volumi > 0,1 mm3 sono necessari per raccogliere dati con statistiche adeguate15. Oltre ai flussi più bassi, devono essere prese in considerazione le proprietà intrinseche dell’interazione tra neutroni e nuclei campione16. La lunghezza di diffusione dei neutroni differisce per gli isotopi dello stesso elemento, una proprietà che può essere sfruttata vantaggiosamente nello scattering neutronico ad angolo piccolo (SANS) per mascherare o evidenziare le regioni di un campione – un processo noto come corrispondenza di contrasto17. Negli esperimenti di diffrazione, la lunghezza di scattering neutronica coerente negativa di H (-3.741 fm per 1H) può portare alla cancellazione delle caratteristiche della mappa della densità di scattering neutronico poiché le lunghezze di scattering neutronico coerenti di altri atomi biologicamente rilevanti, tra cui carbonio (6.6511 fm per 12C), azoto (9.37 fm per 14N), ossigeno (5.803 fm per 16O), fosforo (5.13 fm per 31P) e zolfo (2.804 fm per 32S), sono positivi (Tabella 1)12,14. Inoltre, la grande lunghezza di scattering incoerente di H (25.274 fm), aumenta lo sfondo durante la raccolta dei dati, ostacolando la qualità del set di dati e compromettendo la risoluzione dei dati7. Per aggirare queste limitazioni introdotte da H è necessario, per la diffrazione neutronica, scambiare H con il suo isotopo deuterio, 2H(D), che ha una lunghezza di scattering neutronica coerente positiva (6.671 fm) e una lunghezza di scattering incoerente significativamente inferiore (4.04 fm)19. Ciò può essere ottenuto mediante perdeuterazione, un processo in cui la proteina è espressa da organismi cresciuti in mezzi completamente deuterati che garantiscono la completa incorporazione di D nei siti H20. È anche possibile deuterare parzialmente la proteina sostituendo H con D esclusivamente nei siti scambiabili (gruppi titolabili) mentre i siti legati al carbonio non scambiabili rimangono idrogenati21. Ciò può essere ottenuto mediante la crescita di cristalli proteici idrogenati in liquore madre deuterato22. Più comunemente, tuttavia, lo scambio H/D di proteine idrogenate viene eseguito mediante scambio di vapore in seguito alla crescita di cristalli opportunamente grandi in un buffer a base di H2O23. In questi casi, i cristalli sono montati in un capillare di quarzo e bilanciati a vapore con un liquore madre a base di D20.
I flussi di neutroni limitati alle sorgenti di neutroni si traducono in tempi di raccolta dei dati più lunghi, che vanno da giorni a diverse settimane24. All’ORNL, sia IMAGINE che MaNDi impiegano una banda passante a lunghezza d’onda stretta nell’intervallo 2-6 Å per ottimizzare la raccolta dei dati25. I dati possono essere raccolti a temperatura ambiente o a criotemperatura. La raccolta di crio-dati può potenzialmente migliorare la qualità dei dati e apre la possibilità di intrappolare gli intermedi catalitici. Dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica, un set di dati a raggi X viene in genere raccolto sullo stesso cristallo alla stessa temperatura o su un cristallo coltivato in condizioni identiche26. La raccolta dei dati alla stessa temperatura consente di eseguire il perfezionamento della struttura sia sui dati a raggi X che su quelli neutronici, prevenendo potenziali artefatti indotti dalla temperatura, come cambiamenti nella visibilità e nella posizione delle acque o l’occupazione di residui con conformazioni alternative27. Il perfezionamento dei dati dei neutroni a raggi X congiunti aumenta il rapporto dati-parametri e offre il vantaggio di consentire di perfezionare le coordinate della spina dorsale proteica rispetto ai dati a raggi X, mentre i dati di diffrazione neutronica vengono utilizzati per perfezionare la posizione degli atomi H/D28. Ciò è particolarmente utile quando si utilizzano campioni parzialmente deuterati, in cui è presente la cancellazione della densità dovuta ad atomi di H in siti non scambiabili sulla proteina. Sebbene il numero di strutture a raggi X superi di gran lunga il numero di strutture neutroniche depositate nella Protein Data Bank (PDB), i pacchetti software inizialmente progettati per il perfezionamento dei dati a raggi X sono stati ampliati per includere anche i dati sui neutroni3,29,30. Dopo la raccolta dei dati, i modelli possono essere perfezionati utilizzando pacchetti di perfezionamento come phenix.refine, CNSsolve (nCNS) o SHELXL28,31,32,33. Durante il processo di raffinamento, le mappe di densità di diffusione dei neutroni possono essere visualizzate per il montaggio manuale utilizzando COOT34. Seguendo la soluzione della struttura, le coordinate e i file di dati di diffrazione di neutroni e/o raggi X possono essere sottoposti al PDB, che convaliderà e depositerà il modello, rendendolo disponibile per l’accesso pubblico18,29,30.
L’analisi strutturale delle proteine è un approccio sfaccettato in cui vengono utilizzate numerose tecniche per sondarne la funzione e il meccanismo35. La cristallografia a proteine neutroniche fornisce preziose informazioni chimiche per espandere e integrare i risultati di ulteriori studi come la diffrazione a raggi X, la spettroscopia, la risonanza magnetica nucleare (NMR) o la diffrazione elettronica a microcristalli (microED)36. La diffrazione delle proteine neutroniche è posizionata in modo univoco per fornire informazioni sui meccanismi enzimatici, poiché gli atomi di H sono fondamentali per la loro chimica. L’assenza di danni da radiazioni indotti dai neutroni ne fanno una sonda eccezionalmente adatta allo studio delle metalloproteine37. Presentiamo qui un esempio rappresentativo del processo di diffrazione delle proteine neutroniche dalla preparazione del campione alla raccolta, al perfezionamento e all’analisi dei dati (Figura 1). Cristalli di dimensioni sufficienti per esperimenti di diffrazione neutronica sono stati coltivati della metalloproteina Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D è una metalloproteina contenente rame coinvolta nella degradazione della cellulosa recalcitrante mediante inserimento di atomi di ossigeno al legame glicosidico38,39. Il sito attivo di NcLPMO9D contiene un centro di rame mononucleare all’interno di un caratteristico “parentesi istidinico” composto dall’istidina N-terminale e da una seconda istidina conservata (Figura supplementare 3)40. L’N-terminale degli LPMO fungini è metilato, ma la modifica post-transitoria non si verifica durante l’espressione ricombinante nel lievito. Nello stato di riposo NcLPMO9D, il centro di rame è presente in uno stato di ossidazione Cu2+ e viene attivato mediante riduzione di un singolo elettrone a Cu1+, consentendo all’ossigeno molecolare di legarsi e di essere attivato riducendosi rapidamente a una specie di superossido41,42. La reazione complessiva di NcLPMO9D richiede un’ulteriore aggiunta di un elettrone e due protoni per formare il prodotto polisaccaride idrossilato43. L’identità delle specie di ossigeno attivato responsabili dell’estrazione dell’atomo di idrogeno (HAA) dal substrato polisaccaride non è stata identificata e sono attualmente in corso studi strutturali e computazionali intensivi44,45. Data la chimica redox nel sito attivo di NcLPMO9D, la mitigazione dei danni da radiazioni è particolarmente pertinente. Illustriamo qui la raccolta di dati di temperatura ambiente e criotemperatura su cristalli NcLPMO9D per determinare la struttura NcLPMO9D nello stato di riposo e nella forma ridotta attivata, rispettivamente46. L’accento sarà posto sul montaggio di cristalli proteici, sulla configurazione dello strumento beamline per la raccolta dei dati, sulla preparazione dei dati e dei file di coordinate e sulle fasi di perfezionamento necessarie per modellare una struttura neutronica all-atom.
La cristallografia a proteine neutroniche è una tecnica altamente sensibile per sondare gli stati di protonazione e l’orientamento delle molecole d’acqua nelle proteine. Queste informazioni fanno luce sui meccanismi catalitici delle proteine poiché i cambiamenti nelle interazioni di protonazione e legame idrogeno sono spesso centrali per la chimica enzimatica10. La cristallografia delle proteine neutroniche, sebbene sia una tecnica informativa, ha una serie di fattori che dovrebbero essere presi in considerazione prima di pianificare un esperimento di diffrazione neutronica, vale a dire:
La cristallografia a proteine neutroniche è una tecnica a flusso limitato. A differenza dei set di dati di diffrazione a raggi X, per i set di dati di neutroni sono attesi fattori R più elevati e minore completezza, ridondanza e rapporti segnale-rumore a causa delle limitazioni intrinseche della tecnica (flusso limitato, quasi-Laue, lunghezze d’onda più lunghe). La raccolta dei dati di un singolo frame è in genere di 12 – 18 ore. Il successo di un esperimento dipende in larga misura dalle dimensioni e dalla qualità del campione, con cristalli di 0,1 mm3 che spesso sono il requisito minimo3. La diffrazione neutronica richiede la produzione di grandi quantità di proteine per impostare gocce di cristallizzazione che vanno da 10 a 800 μL. Il volume minimo per la coltivazione di cristalli sufficientemente grandi può essere stimato utilizzando un calcolatore di volume dati i parametri del cristallo e del campione (https://neutrons.ornl.gov/imagine). La crescita di grandi cristalli è stata prevalentemente realizzata dalla diffusione del vapore3. La cristallizzazione a goccia sospesa consente la crescita di cristalli in grandi gocce che vanno da 10-25 μL, mentre le gocce più grandi che vanno fino a ~ 50 μL possono essere impostate utilizzando attrezzature per gocce sedute disponibili in commercio14,54. Le lastre di vetro siliconate a nove pozzetti possono essere utilizzate per impostare gocce molto grandi, con volumi fino a 800 μL. Queste lastre di vetro sono collocate in “scatole sandwich” disponibili in commercio da Hampton Research. Ulteriori tecniche di cristallizzazione includono la cristallizzazione in batch, in cui il limite della dimensione della goccia è dettato dalla nave. L’impostazione dell’esperimento di cristallizzazione in batch può variare da microlitri a millilitri55. La cristallizzazione può essere eseguita anche utilizzando la tecnica della dialisi in cui la proteina viene bilanciata con il precipitante attraverso una membrana di dialisi o per contro-diffusione lungo un gradiente di concentrazione precipitante o attraverso un tappo poroso come l’agarosio56,57. La semina offre un’altra alternativa per ottenere cristalli del volume desiderato. Micro e macrosemina sono stati impiegati con successo per la crescita di grandi cristalli, tra cui grandi cristalli di NcLPMO9D45. Alcune conoscenze del diagramma di fase proteica, compresa l’influenza della temperatura sulla solubilità, aiutano nella crescita di grandi cristalli.
Quando si pianifica un esperimento di diffrazione neutronica, è essenziale ottimizzare la preparazione proteica per massimizzare il rapporto segnale-rumore durante la raccolta dei dati di diffrazione7. Per aggirare la cancellazione della densità e l’elevata dispersione incoerente causata dagli atomi H, le mappe SLD dei neutroni possono essere migliorate scambiando gli atomi H con il suo isotopo D, che possiede una lunghezza di scattering coerente positiva e una bassa lunghezza di scattering incoerente. Per fare ciò, viene eseguito lo scambio di vapore del cristallo proteico idrogenato contro il tampone di cristallizzazione deuterato. Ciò garantisce lo scambio H/D delle molecole di solvente e degli atomi di proteina H labile e titolabile23. Lo scambio di vapore viene eseguito montando il cristallo idrogenato in un capillare di quarzo con “tappi” tampone di cristallizzazione deuterati a base di D2O e rappresenta una tecnica efficace e delicata che viene spesso applicata14,23,35. Lo scambio può richiedere diverse settimane e preferibilmente richiede che il buffer deuterato venga cambiato frequentemente per garantire il massimo scambio H / D. Lo scambio H/D può essere eseguito anche immergendo direttamente il cristallo in un buffer deuterato. Per evitare di sottoporre il cristallo sotto stress a causa dell’esposizione a D2O, il processo di ammollo deve essere eseguito gradualmente aumentando in modo incrementale il rapporto D2O:H2O58. Oltre a questo, la cristallizzazione di proteine idrogenate può essere eseguita anche in tampone deuterato per lo scambio H/D in siti H labili22,59. Va notato, tuttavia, che il tampone a base di D2O ha un effetto sulla solubilità delle proteine che richiede un ulteriore aggiustamento delle condizioni note basate su H2O3,59. In alcuni casi è stato anche osservato che i buffer basati su D2O portano a cristalli più piccoli59. Lo scambio completo di atomi H titolabili e legati al carbonio in D può essere ottenuto esprimendo proteine in mezzi deuterati per generare un campione persouterato20. Le mappe SLD neutroniche risultanti del campione persouterato saranno significativamente migliorate, non mostrando più la cancellazione della densità della controparte del campione idrogenato. Ciò è utile quando si caratterizza H / D legato a siti non scambiabili in una proteina o in un cofattore. Tuttavia, l’espressione della proteina perdeuterata è sia ad alto costo che a bassa resa60. L’Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) offre una struttura di deuterazione per gli utenti che cercano di generare un campione persouterato (https://www.ornl.gov/facility/csmb). L’espressione perdeuterata viene tipicamente eseguita in un bioreattore sulla scala 1 L che produce ~ 50 mg di proteina purificata61.
Dopo la raccolta dei dati di diffrazione neutronica, viene eseguito il perfezionamento e la costruzione di modelli interattivi. Il perfezionamento può essere eseguito utilizzando più suite software tra cui phenix.refine, nCNS o SHELXL28,31,32,33. La suite Phenix è il software più comunemente utilizzato per il perfezionamento dei dati di diffrazione dei neutroni in combinazione con Coot che viene utilizzato per costruire manualmente il modello dalle mappe SLD di neutroni34. Sebbene sia Phenix che Coot consentano l’elaborazione dei dati di diffrazione neutronica, potrebbero mancare di alcune caratteristiche necessarie per elaborare le idiosincrasie associate ai dati sui neutroni e ai campioni deuterati. Ad esempio, Coot non contiene l’ottimizzazione geometrica per i residui deuterati, il che può portare a complicazioni durante la costruzione del modello poiché la funzione “Real Space Refine” provoca residui “esplosivi” (Figura supplementare 26)62. Questo può essere risolto generando file di ritenuta per tutti i residui deuterati. Tuttavia, questo è un processo intensivo e tali librerie non sono attualmente disponibili pubblicamente. Quando si eseguono perfezionamenti in Phenix, i siti H / D intercambiabili saranno inizialmente impostati su 0,50 occupazione per H e D. Man mano che vengono eseguiti perfezionamenti, l’occupazione di H e D sarà raffinata in base alle mappe SLD di neutroni. Durante la costruzione di modelli interattivi, le mappe Fo-Fc a densità di differenza sono molto istruttive nella valutazione delle occupazioni H / D. Le mappe possono essere utilizzate per determinare quali siti possiedono un’elevata occupazione D, il che è particolarmente informativo nel sito attivo in cui gli stati di protonazione sono cataliticamente rilevanti63. Situazioni ambigue sorgono, tuttavia, quando l’H:D l’occupazione è vicina a 0.70:0.30, il che si traduce in una completa cancellazione del segnale nelle mappe SLD di neutroni64. Va anche tenuto conto del fatto che i set di dati di neutroni quasi-Laue hanno spesso una completezza intorno all’80%, che è inferiore al ≥ 98% osservato di routine per i dati di diffrazione a raggi X. Quando si raffinano i dati di diffrazione neutronica in Phenix, le ampiezze osservate mancanti (Fo) vengono quindi calcolate dal modello per completare l’elenco di riflessione, introducendo così la distorsione del modello. Per tenere conto di questo potenziale pregiudizio, le mappe “no_fill” dovrebbero essere esaminate durante la costruzione di modelli interattivi anziché le mappe “riempite”.
Gli utenti possono scegliere di eseguire un raffinamento congiunto dei dati a raggi X / neutroni della loro struttura o un raffinamento solo dei dati sui neutroni. La visualizzazione di mappe SLD di neutroni, in particolare a bassa risoluzione, può inizialmente essere sconcertante soprattutto per una proteina idrogenata in cui H è ancora presente in siti non scambiabili nonostante lo scambio di vapore H / D. Ciò si traduce in cancellazioni di mappe di densità neutronica, dando l’impressione di mappe discontinue65,66. La raccolta di un set di dati a raggi X corrispondente integra vantaggiosamente queste cancellazioni in un perfezionamento congiunto (Figura 13A e Figura 13B). Una strategia di raffinamento congiunto comporta tipicamente il perfezionamento delle coordinate della spina dorsale proteica rispetto ai dati a raggi X, mentre i dati di diffrazione neutronica vengono utilizzati per perfezionare la posizione e l’occupazione degli atomi H/D nei siti scambiabili28. Poiché l’introduzione dell’occupazione congiunta H/D nei siti scambiabili aumenta il numero di parametri in fase di perfezionamento, un perfezionamento congiunto con i dati a raggi X aumenta anche il rapporto dati-parametri. Un raffinamento congiunto richiede che un set di dati a raggi X corrispondente sia raccolto alla stessa temperatura sullo stesso cristallo o su un cristallo coltivato nelle stesse condizioni. Per i dati di diffrazione neutronica raccolti a temperatura ambiente (300K), il corrispondente set di dati a raggi X deve essere raccolto a temperatura ambiente utilizzando una strategia di raccolta dati a basse dosi per limitare i danni da radiazioni. I campioni perdeuterati, al contrario, forniscono mappe SLD neutroniche migliorate e continue poiché non possiedono la stessa grandezza della cancellazione del segnale H / D. Tuttavia, la lunghezza di scattering neutronico di alcuni elementi, tra cui metalli e zolfo, li rende scarsamente visibili nelle mappe SLD dei neutroni, anche se la proteina è stata perdeuterata (Figura 13C-F)18. Se un metallo deve essere caratterizzato, è meglio utilizzare la diffrazione a raggi X in un raffinamento congiunto o applicare tecniche spettroscopiche per integrare gli esperimenti di diffrazione. I perfezionamenti dei dati solo neutroni vengono spesso eseguiti quando il set di dati sui neutroni ha un’alta risoluzione o se è stata utilizzata una proteina perdeuterata. Inoltre, il perfezionamento dei dati solo neutroni è particolarmente utile se si sta studiando una proteina altamente sensibile ai danni da radiazioni, poiché una struttura derivata dai raggi X può possedere artefatti indotti da radiazioni. Se si vuole eseguire un perfezionamento solo per i dati relativi ai neutroni, è necessario accertare se il corrispondente set di dati sui neutroni ha una completezza e una risoluzione sufficienti.
ORNL offre due strutture per la raccolta di dati di diffrazione neutronica: la beamline IMAGINE presso l’HFIR e la beamline MaNDi presso l’SNS36,67. Mentre entrambi gli strumenti forniscono mezzi efficaci per la raccolta di un set di dati di diffrazione neutronica che utilizza principi simili, ogni strumento ha specifiche uniche che dovrebbero essere prese in considerazione quando si richiede il tempo del fascio. IMAGINE raccoglie dati quasi-Laue ed è ottimizzato per la raccolta di dati a temperatura ambiente su cristalli con celle unitarie fino a ~ 100 Å. MaNDi può essere utilizzato per la raccolta di dati di temperatura ambiente e crio-temperatura utilizzando la raccolta TOF-Laue su cristalli con celle unitarie fino a ~ 300 Å. Prima di raccogliere un set di dati completo, viene eseguito un test sul cristallo per valutare la qualità del modello di diffrazione ottenuto in cui il cristallo è esposto al fascio di neutroni per un singolo fotogramma. Se il cristallo è di qualità sufficiente, un set di dati completo di diffrazione neutronica verrà raccolto, indicizzato, integrato, ridimensionato e unito in un processo analogo all’elaborazione dei dati a raggi X. IMAGINE utilizza Lauegen e Lscale e MaNDi utilizza il pacchetto Mantid e impiega raccordi a profilo tridimensionale48,50,51,68,69,70. Agli scienziati che diventano utenti in una di queste strutture verrà fornito un set di dati in formato MTZ o HKL per ulteriori analisi.
La diffrazione neutronica è una tecnica non distruttiva e altamente sensibile per sondare lo stato di protonazione e le interazioni di legame idrogeno delle macromolecole biologiche. È particolarmente utile per proteine fotosensibili e metalloproteine. Diverse considerazioni riguardanti la tecnica e l’elaborazione dei dati devono essere prese in considerazione prima di condurre un esperimento, tuttavia il risultato produce risultati che possono fornire preziose informazioni sul meccanismo catalitico della proteina di interesse. La cristallografia delle proteine neutroniche integra studi computazionali, strutturali, biochimici e spettroscopici, rendendola uno strumento prezioso nella cassetta degli attrezzi del biologo delle tecniche utilizzate per caratterizzare le macromolecole biologiche.
The authors have nothing to disclose.
Esperimenti di espressione, purificazione e cristallizzazione delle proteine sono stati condotti presso il Center for Structural Molecular Biology (CSMB), una struttura utente di ricerca biologica e ambientale del Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti presso l’Oak Ridge National Laboratory. I dati di diffrazione neutronica sono stati raccolti presso BL-11B MaNDi presso la Spallation Neutron Source (SNS) presso l’ORNL, sponsorizzata dalla Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Gli autori ringraziano Brendan Sullivan per l’assistenza nella riduzione dei dati. I dati di diffrazione a raggi X sono stati raccolti presso le strutture del Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) della North Carolina State University, supportata dallo Stato della Carolina del Nord. GCS riconosce il sostegno in parte della National Research Foundation (NRF), del Sudafrica e del programma Graduate Opportunities (GO!) presso l’ORNL. FM riconosce il supporto di USDA NIFA Hatch 211001.
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round – Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 – 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 – 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 – 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 – 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |