Без этикетки Количественные Протеомика Рабочий процесс для Discovery-Driven Хост-патоген взаимодействия
Summary
Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.
Abstract
Технологические достижения массовой спектрометрии (МС) на основе количественной протеомии открывает много неоткрытых путей для анализа глобального протеома организма в различных условиях. Эта мощная стратегия, применяемая к взаимодействию микробных патогенов с желаемым хозяином, всесторонне характеризует обе точки зрения на инфекцию. В этом документе описывается безымянная количественная оценка (ЛФЗ) инфекции криптококковых неоформанов, грибкового преподавательского внутриклеточного патогена, который является возбудителем смертельной болезни криптококкоза, в присутствии увековеченных клеток макрофага. В протоколе подробно изготовительная методика приготовления белка как для патогенных, так и для клеток млекопитающих в рамках одного эксперимента, что приводит к соответствующему представлению пептида для анализа жидко-хроматографии (LC)-MS/MS. Высокая пропускная способность общего характера ЛФЗ позволяет широкий динамический диапазон идентификации белка и количественной оценки, а также передачи в любой принимающей патогенной инфекции настройки, сохраняя крайнюю чувствительность. Метод оптимизирован для каталогизации обширных, объективных профилей изобилия белка патогена в инфекционно-имитирующих условиях. В частности, метод, продемонстрированные здесь, предоставляет важную информацию о патогенезах C. neoformans, таких как производство белка, необходимого для вирулентности, и определяет критически важные белки-хозяина, реагирующие на микробное вторжение.
Introduction
Распространенность инвазивных грибковых инфекций значительно возрастает и коррелирует с неприемлемо высокими показателями смертности, чаще всего сообщается у людей с иммунодефицитной предрасположенностью1. Криптококковые неоформаны – это пресловутый оппортунистический грибковый патоген, способный к внутриклеточному выживанию в клетках макрофага хозяина. Неадекватное противогрибковое вмешательство приводит к грибковому распространению и опасным для жизни проявлениям криптококкового менингита и менингоэнцефалита2,3. Глобальное повышение иммунокомпромиссного статуса потребовало параллельного увеличения использования противогрибковых препаратов, при котором многие грибковые виды, в том числе C. neoformans, все больше развивалисьсопротивление к 4,5,6. Поэтому крайне важно внедрить надежные и эффективные технологии для ответа на жизненно важные биологические вопросы, касающиеся ответных мер принимающей стороны на оборону и микробного патогенеза.
Новая эра технологического прогресса в масс-спектрометрии (МС), включая генерацию мощных вычислительных и биоинформатических трубопроводов, обеспечивает основу для интегративного видения для масштабного анализа исследованийхост-патогенов 7,8. Обычный патогенез-управляемый протеомный анализ обычно профилирует мнение инфекции с точки зрения хозяина или патогена, включая комплексные методологии, такие как профилирование корреляции белка, хроматография сродства в сочетании с протеомикой, и interactomics9. Исследования вирулентности опасных патогенов в принимающей системе имеют огромное клиническое значение; однако применение двойного перспективного анализа в одном эксперименте ранее считалось недостижимым. Например, точка зрения патогена к инфекции часто перегружены весьма обильные белки хозяина в результате снижения чувствительности для обнаружения низкоо изобилия грибковыхбелков 7. Кроме того, высокая сложность выборки предлагает многим целям исследовать в одной экспериментальной системе и оказывается сложной задачей для выяснения механизмов действия для конкретного патогенного белка.
Протеомика снизу вверх является популярным методом MS, который позволяет управляемой подготовки образца, в котором пептиды генерируются последовательности конкретных энзиматических пищеварения следуют жидкие хроматографии разделения, идентификации и количественной оценки MS10,11. Здесь мы представляем метод, демонстрирующий стратегию приобретения, зависящая от данных, направленную на достижение беспристрастного охвата протеома на основе инфекции или «инфекции». В частности, без этикетки количественной оценки (LF) проливает зависимость от химических или метаболических этикеток для надежной и точной идентификации изменений уровня белка через несколько протеомов, снижение обработки образцови обработки шаги 12,13. Это универсальное применение допрашивает произведенные белки в данный момент в клетке, независимой от ожидаемого производства белка; таким образом, новые идеи могут быть обнаружены, которые имеют решающее значение для инфекции.
Рабочий процесс, описанный в настоящем, оптимизирован для изучения изменений уровня белка C. неоформанов во время инфекционно-мимикряющих состояний с иммунными клетками хозяина(рисунок 1). Вместо того, чтобы полагаться на изоляцию и разделение типов клеток, этот подход извлекает хозяина и патогена протеом вместе, и использует биоинформатическое разделение с использованием двух конкретных организмов баз данных для различения видового производства белка. Этот метод дает преимущества для неограниченного числа образцов, которые будут обработаны без дополнительных дорогостоящих подготовительных шагов, необходимых в изотопных исследованиях маркировки или фракциоции. Кроме того, этот рабочий процесс поддерживает оптимизированные протоколы извлечения белка, переносяные в широкий спектр грибковых и бактериальных патогенов, способных нацеливаться и заражать иммунные клетки хозяина. В целом, в этом протоколе излагаются шаги для завершения беспристрастной извлечения белка и обработки образцов для MS с высоким разрешением, а затем данные и статистический анализ, способный обеспечить богатые знания грибковых белков, важных для инфекции в сочетании с всеобъемлющим профилированием ответной меры защиты хозяина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в протоколе включают подготовку клеток макрофагов и сбор образцов совместной культуры для обработки белка с минимальным нарушением клеток. Важно выполнять шаги мытья, инокулации и удаления клеток макрофагов адепта мягко и тщательно, чтобы предотвратить ненужныйлиз ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-ра Джонатана Кригера (Jonathan Krieger) из Bioinformatics Solutions Inc. за эксплуатацию масс-спектрометра для репрезентативных экспериментов, а также членов группы Геддес-Макалистер за помощь в экспериментальной настройке и обратной связи с рукописями. Авторы признают поддержку финансирования, в частности, от Banting Research Foundation – Jarislowsky стипендий Discovery Award, Научно-исследовательский фонд «Новые границы» (NFRFE-2019-00425) и Канадский фонд инноваций (JELF 38798) для J.G.M., а также стипендия выпускников NSERC Canada – магистры и стипендии для выпускников Онтарио для B.B., а также стипендия королевы Елизаветы II в области науки и техники для A.S.
Materials
| 100 mM Tris-HCl, pH 8.5 | Fisher Scientific | BP152-1 | Maintain at 4°C |
| 60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 174888 | |
| 6-well cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Acetonitrile, MS grade | Pierce | TS-51101 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1099510001 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 34850-1L | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | ThermoFisher Scientific | A643-500 | Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month. |
| Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System | Fisher Scientific | 13-717-300 | Not essential, serological pipettes can be used to remove media. |
| C18 resin | 3M Empore | 3M2215 | |
| Cell Scrapers | VWR | 10062-906 | Not essential, other methods to release macrophage cells can be used. |
| Centrifugal vaccuum concentrator | Eppendorf | 07-748-15 | |
| Complete Filtration Unit | VWR | 10040-436 | |
| Conical falcon tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Not essential, haemocytometer can be used as an alternative. |
| CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega | G1780 | |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 12483020 | Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation |
| Haemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| High-performance liquid chromatography system | ThermoFisher Scientific | LC140 | Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples. |
| High-resolution mass spectrometer | ThermoFisher Scientific | 726042 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich | I6125 | Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| LoBind Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 13-698-794 | |
| MaxQuant | https://maxquant.org/ | MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 13864457 | |
| Penicillin : Streptomycin 10k/10k | VWR | CA12001-692 | Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation. |
| Peptide separation columns | ThermoFisher Scientific | ES803 | |
| Perseus Software | http://maxquant.net/perseus/ | ||
| Phosphate Buffered Saline | VWR | CA12001-676 | Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use. |
| Pierce BCA Protein Assay | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Pipette, Disposable Serological (10 mL) | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix | Fisher Scientific | 14955235 | |
| Probe sonciator | ThermoFisher Scientific | 100-132-894 | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium dodecyl sulfate | ThermoFisher Scientific | 28364 | 20% (w/v) |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| STAGE tipping centrifuge | Sonation | STC-V2 | |
| Thermal Shaker | VWR | NO89232-908 | |
| Trifluoroacetic acid | ThermoFisher Scientific | 85183 | |
| Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade | Pierce | A40007 | Maintain at -20 °C. |
| Ultrasonic bath | Bransonic | A89375-450 | Stored in cold room (4C) |
| Urea | Sigma Aldrich | U1250-1KG | Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly). |
| Yeast-extract peptone dextrose broth | BD Difco | BM20 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision. Journal of Fungi. , (2017).
- Tugume, L., et al. HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts. Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).
- Rajasingham, R., et al. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2017).
- Perfect, J. R. The antifungal pipeline: A reality check. Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).
- Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development. Journal of Fungi. , (2019).
- Sukumaran, A., et al. Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics. J Leukocyte Biol. , (2019).
- Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks. Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes. Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).
- Cox, J., et al. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics. Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. , (2011).
- Zhong, Z., Pirofski, L. A. Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies. Infection and Immunity. , (1996).
- Nicola, A. M., et al. Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans. Infection and Immunity. , (2012).
- Ball, B., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans. Current Protocols in Microbiology. , (2019).
- Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils. Current Protocols in Immunology. , (2019).
- Geddes, J. M. H., et al. Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A. BMC Microbiology. , (2015).
- Geddes, J. M. H., et al. Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation. mBio. 7 (1), 1-15 (2016).
- Al Shweiki, M. H. D. R., et al. Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance. Journal of Proteome Research. , (2017).
- Ong, S. E. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Borner, G. H. H. Organellar Maps Through Proteomic Profiling – A Conceptual Guide. Molecular & Cellular Proteomics. , (2020).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).
- Kugadas, A., et al. Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections. Journal of Leukocyte Biology. , (2019).
- Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface. Proteomics. , (2020).
- Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).
