Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

A prevalência de infecções fúngicas invasivas está aumentando muito e está correlacionada com taxas inaceitáveis de mortalidade elevadas, mais comumente relatadas em indivíduos com predisposições imunodeficientes¹. Cryptococcus neoformans é um notória patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivência intracelular dentro de células macrófagos hospedeiras. Intervenção antifúngica inadequada resulta em disseminação fúngica e manifestações de risco de vida de meningite criptocócica e meningoencefalite^2,3. O aumento global do status imunocomprometido exigiu um aumento paralelo no uso de agentes antifúngicos, nos quais muitas espécies fúngicas, incluindo C. neoformans, têm evoluído cada vez mais resistência para^4,5,6. Portanto, é imprescindível implementar tecnologias robustas e eficientes para responder a questões biológicas vitais sobre resposta à defesa do hospedeiro e patogênese microbiana.

A nova era do avanço tecnológico na espectrometria de massa (MS), incluindo a geração de poderosos gasodutos computacionais e bioinforáticos, fornece a base para uma visão integrativa para análise em larga escala da pesquisa hospedeira-patógeno^7,8. A análise proteômica convencional orientada pela patogênese geralmente perfila a visão da infecção da perspectiva hospedeira ou patógena, incluindo metodologias abrangentes como perfil de correlação de proteínas, cromatografia de afinidade combinada com proteômica e interactomics⁹. As investigações sobre a virulência de patógenos perigosos em um sistema hospedeiro são de imensa importância clínica; no entanto, a aplicação de uma análise de dupla perspectiva em um único experimento foi anteriormente considerada inatingível. Por exemplo, a perspectiva do patógeno em relação à infecção é frequentemente sobrecarregada por proteínas hospedeiras altamente abundantes, resultando em sensibilidade reduzida para a detecção de proteínas fúngicas de baixa abundantes⁷. Além disso, a alta complexidade amostral convida muitos alvos a investigar em um único sistema experimental e se mostra desafiador para elucidar mecanismos de ação para uma proteína patógena específica.

A proteômica de baixo para cima é uma técnica popular de MS que permite a preparação de amostras gerenciáveis, na qual os peptídeos são gerados pela digestão enzimática específica da sequência seguida pela separação, identificação e quantificação da cromatografia líquida pela MS^10,11. Aqui, apresentamos um método demonstrando uma estratégia de aquisição dependente de dados com o objetivo de alcançar uma cobertura imparcial de um proteome baseado em infecção ou “infectome”. Especificamente, a quantificação sem rótulos (LFQ) libera a dependência de rótulos químicos ou metabólicos para identificação robusta e precisa de alterações no nível de proteínas em múltiplos proteomes, reduzindo as etapas de manuseio e processamento de amostras^12,13. Esta aplicação universal interroga proteínas produzidas em um dado momento dentro de uma célula independente de qualquer produção de proteína esperada; assim, novos insights podem ser descobertos que são críticos para a infecção.

O fluxo de trabalho descrito aqui é otimizado para explorar mudanças no nível de proteína de C. neoformans durante condições de imitação de infecções com células imunes hospedeiras(Figura 1). Em vez de depender do isolamento e separação dos tipos celulares, essa abordagem extrai o hospedeiro e o proteome patógeno juntos, e utiliza a separação bioinformática usando dois bancos de dados específicos do organismo para distinguir a produção de proteínas específicas das espécies. Este método oferece vantagens para um número ilimitado de amostras a serem processadas sem as etapas de preparação extra dispendias necessárias em estudos de rotulagem ou fracionamento baseados em isótopos. Além disso, este fluxo de trabalho suporta protocolos otimizados de extração de proteínas transferíveis para uma ampla gama de patógenos fúngicos e bacterianos capazes de atingir e infectar células imunes hospedeiras. No geral, este protocolo descreve as etapas para concluir uma extração de proteína imparcial e processamento de amostras para MS de alta resolução, seguida de dados e análise estatística, capaz de fornecer uma riqueza de conhecimento de proteínas fúngicas significativas para infecção combinada com o perfil abrangente da resposta à defesa do hospedeiro.