Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

Die Prävalenz invasiver Pilzinfektionen nimmt enorm zu und korreliert mit unannehmbar hohen Sterblichkeitsraten, die am häufigsten bei Personen mit immundefiziden Veranlagungen berichtet werden¹. Cryptococcus neoformans ist ein berüchtigter opportunistischer Pilzerreger, der in der Lage ist, intrazelluläre sesäichliche Überleben innerhalb von Wirtsmakrophagenzellen zu überleben. Unzureichende antimykotische Intervention führt zu Pilzverbreitung und lebensbedrohliche Manifestationen von kryptokokkaler Meningitis und Meningoenzephalitis^2,3. Die globale Zunahme des immungeschwächten Status hat eine parallele Zunahme der Verwendung von Antimykotika gefordert, in denen viele Pilzarten, einschließlich C. Neoformans, zunehmend Resistenzen gegen^4,5,6entwickelt haben. Daher ist es unerlässlich, robuste und effiziente Technologien zu implementieren, um lebenswichtige biologische Fragen in Bezug auf die Reaktion auf die Wirtsabwehr und die mikrobielle Pathogenese zu beantworten.

Das neue Zeitalter des technologischen Fortschritts in der Massenspektrometrie (MS), einschließlich der Erzeugung leistungsfähiger computergestützter und bioinformatischer Pipelines, bildet die Grundlage für eine integrative Vision für eine groß angelegte Analyse der Wirtspathogenforschung^7,8. Herkömmliche pathogenese-gesteuerte proteomische Analysen profilieren häufig die Sicht der Infektion entweder aus der Perspektive des Wirts oder des Krankheitserregers, einschließlich umfassender Methoden wie Proteinkorrelationsprofilierung, Affinitätschromatographie in Kombination mit Proteomik und Interkomik⁹. Untersuchungen zur Virulenz gefährlicher Krankheitserreger in einem Wirtssystem sind von immenser klinischer Bedeutung; Die Anwendung einer dualen Perspektivanalyse in einem einzigen Experiment galt jedoch früher als unerreichbar. Zum Beispiel wird die Perspektive des Erregers auf eine Infektion oft von reichlich reichlich vorhandenen Wirtsproteinen überwältigt, was zu einer verringerten Empfindlichkeit für den Nachweis von schwach vorhandenen Pilzproteinen^{führt 7}. Darüber hinaus lädt die hohe Probenkomplexität viele Ziele ein, in einem einzigen experimentellen System zu untersuchen, und erweist sich als schwierig, Wirkmechanismen für ein bestimmtes Pathogenprotein aufzuklären.

Bottom-up-Proteomik ist eine beliebte MS-Technik, die eine überschaubare Probenvorbereitung ermöglicht, bei der Peptide durch sequenzspezifische enzymatische Verdauung erzeugt werden, gefolgt von Flüssigkeitschromatographie-Trennung, Identifizierung und Quantifizierung durch MS^10,11. Hier stellen wir eine Methode vor, die eine datenabhängige Erfassungsstrategie demonstriert, die darauf ausgerichtet ist, eine unvoreingenommene Abdeckung eines infektionsbasierten Proteoms oder “Infektoms” zu erreichen. Insbesondere die etikettenfreie Quantifizierung (LFQ) verringert die Abhängigkeit von chemischen oder metabolischen Etiketten für eine robuste und genaue Identifizierung von Proteinstandsänderungen über mehrere Proteome hinweg, wodurch die Probenhandhabung und die Verarbeitungsschritte^12,13reduziert werden. Diese universelle Anwendung fragt produzierte Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle unabhängig von der erwarteten Proteinproduktion ab; So können neue Erkenntnisse entdeckt werden, die für eine Infektion entscheidend sind.

Der hier beschriebene Workflow ist optimiert, um Veränderungen des Proteinspiegels von C. Neoformanen während der Infektions-Mimikking-Bedingungen mit Wirtsimmunzellen zu untersuchen (Abbildung 1). Anstatt sich auf die Isolierung und Trennung von Zelltypen zu verlassen, extrahiert dieser Ansatz das Wirts- und Erregerproteom zusammen und nutzt die bioinfordische Trennung mithilfe von zwei organismusspezifischen Datenbanken, um die artspezifische Proteinproduktion zu unterscheiden. Diese Methode bietet Vorteile für eine unbegrenzte Anzahl von Proben, die ohne die zusätzlichen kostspieligen Vorbereitungsschritte verarbeitet werden, die in isotopenbasierten Etikettierungsstudien oder Fraktionen erforderlich sind. Darüber hinaus unterstützt dieser Workflow optimierte Proteinextraktionsprotokolle, die auf eine Breite von Pilz- und Bakterienerregern übertragbar sind, die in der Lage sind, Wirtsimmunzellen anzusprechen und zu infizieren. Insgesamt skizziert dieses Protokoll die Schritte zur Durchführung einer unvoreingenommenen Proteinextraktion und Probenverarbeitung für hochauflösende MS, gefolgt von Daten und statistischen Analysen, die in der Lage sind, eine Fülle von Kenntnissen über Pilzproteine bereitzustellen, die für eine Infektion wichtig sind, kombiniert mit einer umfassenden Profilierung der Host-Abwehrreaktion.