Procedimentos de transplante de medula óssea em camundongos para estudar hematopoiese clonal

A hematopoiese clonal (CH) é uma condição que é frequentemente observada em idosos e ocorre como resultado de um clone de célula hematopoiética e progenitora expandida (HSPC) portador de uma mutação genética¹. Foi sugerido que, aos 50 anos, a maioria dos indivíduos terá adquirido uma média de cinco mutações exônicas em cada HSPC^2,mas a maioria dessas mutações resultará em pequenas ou nenhuma consequências fenotípicas para o indivíduo. No entanto, se por acaso uma dessas mutações confere uma vantagem competitiva ao HSPC — como promover sua proliferação, auto-renovação, sobrevivência ou alguma combinação delas — isso pode levar à expansão preferencial do clone mutante em relação aos outros HSPCs. Como resultado, a mutação se espalhará cada vez mais pelo sistema hematopoiético à medida que o HSPC mutado dá origem a células sanguíneas maduras, levando a uma população distinta de células mutantes dentro do sangue periférico. Enquanto mutações em dezenas de diferentes genes de driver candidatos têm sido associadas a eventos clonais dentro do sistema hematopoiético, entre eles, mutações no DNA metiltransferase 3 alfa(DNMT3A) e dez onze translocação 2(TET2) são as mais prevalentes³. Vários estudos epidemiológicos descobriram que indivíduos que carregam essas mutações genéticas têm um risco significativamente maior de doenças cardiovasculares (DCV), acidente vascular cerebral e mortalidade causal^3,4,5,6,7. Embora esses estudos tenham identificado que existe associação entre ACS e aumento da incidência de DCV e AVC, não sabemos se essa relação é causal ou um epifenômeno compartilhado com o processo de envelhecimento. Para obter uma melhor compreensão dessa associação, são necessários modelos animais adequados que recapitulem corretamente a condição humana do ACS.

Vários modelos de animais CH foram estabelecidos pelo nosso grupo e outros usando zebrafish, camundongos e primatas não humanos^{8,9,10,11,12,13,14}. Esses modelos frequentemente usam métodos de reconstituição hematopoiética por meio do transplante de células geneticamente modificadas, às vezes usando recombinação cre-lox ou o sistema CRISPR. Essa abordagem permite a análise de uma mutação genética específica em células hematopoiéticas para avaliar como ela contribui para o desenvolvimento da doença. Além disso, esses modelos geralmente empregam células congênicas ou repórteres para distinguir os efeitos das células mutantes de células normais ou do tipo selvagem. Em muitos casos, um regime pré-condicionado é necessário para engrafar com sucesso células-tronco hematopoiéticas doadoras.

Atualmente, o transplante de medula óssea para camundongos receptores pode ser dividido em duas categorias principais: 1) condicionamento mieleloblativo e 2) transplante não condicionado. O condicionamento mieloblativo pode ser alcançado por um dos dois métodos, a ver: irradiação corporal total (TCE) ou quimioterapia¹⁵. O TBI é realizado submetendo o receptor a uma dose letal de irradiação gama ou raios-X, gerando quebras de DNA ou cruzamentos dentro de células rapidamente divididas, tornando-as irreparáveis¹⁶. Busulfan e ciclofosfameda são duas drogas quimioterapias comumente usadas que interrompem o nicho hematopoiético e causam danos ao DNA para células rapidamente divididas. O resultado líquido do pré-condicionamento mieloblativo é apoptose das células hematopoiéticas, que destrói o sistema hematopoiético do receptor. Essa estratégia não só permite o enxerto bem-sucedido dos HSPCs doadores, mas também pode evitar a rejeição do enxerto suprimindo o sistema imunológico do receptor. No entanto, o pré-condicionamento mieloblativo tem efeitos colaterais graves, como danos a tecidos e órgãos e suas células imunes residentes, bem como destruição do nicho de medula óssea nativo¹⁷. Por conseguinte, foram propostos métodos alternativos para superar esses efeitos colaterais indesejáveis, particularmente no que diz respeito aos danos aos órgãos de interesse. Esses métodos incluem a irradiação blindada de camundongos receptores e o BMT adotivo para camundongos não condicionados^9,17. Proteger o tórax, a cavidade abdominal, a cabeça ou outras regiões da irradiação pela colocação de barreiras de chumbo mantém os tecidos de interesse protegidos dos efeitos nocivos da irradiação e mantém sua população de células imunes residentes. Por outro lado, o BMT adotivo de HSPCs para camundongos não condicionados tem uma vantagem adicional porque preserva o nicho hematopoiético nativo. Neste manuscrito, descrevemos os protocolos e resultados do enxerto de HSPC após vários regimes de transplante em camundongos, especificamente a entrega de HSPC a camundongos TBI, a camundongos parcialmente protegidos da irradiação e a ratos não condicionados. O objetivo geral é ajudar os pesquisadores a entender os diferentes efeitos fisiológicos de cada método, bem como como eles afetam os desfechos experimentais no cenário de ACS e doenças cardiovasculares.