Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio
Summary
Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.
Abstract
A gônada embrionária masculina Drosophila melanogaster é um modelo vantajoso para estudar vários aspectos da biologia do desenvolvimento, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de células germinativas, biologia piRNA e formação de nicho. Aqui, apresentamos uma técnica de dissecção ao vivo da gônada ex vivo durante um período em que a imagem ao vivo in vivo é altamente ineficaz. Este protocolo descreve como transferir embriões para um prato de imagem, escolher embriões masculinos adequadamente encenados e dissecar a gônada de seu tecido circundante, mantendo sua integridade estrutural. Após a dissecção, as gôngas podem ser imagens usando um microscópio confocal para visualizar processos celulares dinâmicos. O procedimento de dissecção requer tempo e destreza precisos, mas fornecemos informações sobre como prevenir erros comuns e como superar esses desafios. Pelo que sabemos, este é o primeiro protocolo de dissecção para a gônada embrionária Drosophila , e permitirá imagens vivas durante uma janela de tempo inacessível. Esta técnica pode ser combinada com manipulações transgênicas específicas do tipo farmacológico ou celular para estudar quaisquer processos dinâmicos que ocorram dentro ou entre as células em seu ambiente gonadal natural.
Introduction
O teste de melanogaster Drosophila tem servido de paradigma para nossa compreensão de muitos processos celulares dinâmicos. Estudos desse modelo lançaram luz sobre a regulação da divisão de células-tronco 1,2,3, desenvolvimento de células germinativas 4,5, biologia piRNA 6,7,8 e eventos de sinalização de células-tronco de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo é vantajoso porque é geneticamente tratável14,15 e é um dos poucos onde podemos viver células-tronco em seu ambiente natural 3,16,17,18. No entanto, a imagem viva deste modelo tem sido limitada ao tecido adulto e aos estágios embrionários iniciais, deixando uma lacuna em nosso conhecimento da dinâmica gonadal no embrião tardio, o estágio preciso quando o nicho está se formando e começando a funcionar.
A gônada embrionária em estágio tardio é uma esfera, consistindo de células de nicho somáticas no anterior, e células germinativas enciontadas por células gândalos somáticas em todas as regiões mais posteriores19. Este órgão pode ser retratado ao vivo até o início do estágio 17 17,20,21. Novas imagens são evitadas devido ao início de contrações musculares em larga escala. Essas contrações são tão severas que empurram a gônada para fora do quadro de imagem, e tal movimento não pode ser corrigido com software de imagem. Nosso laboratório está interessado em desvendar os mecanismos de formação de nicho, que ocorre durante esse período indescritível para imagens ao vivo. Por isso, geramos uma abordagem ex vivo para imagem viva da gônada a partir do Estágio 16 embrionário, facilitando o estudo da dinâmica celular durante esse período crucial de desenvolvimento da gônada. Trabalhos anteriores do nosso laboratório mostram que essa imagem ex vivo recapitula fielmente o desenvolvimento da gônsia vivo 17. Esta técnica é a primeira e única do seu tipo para a gônus embrionária Drosophila.
Aqui, apresentamos o protocolo de dissecção necessário para ex vivo live-imaging da gônada durante estágios embrionários tardios. Este protocolo pode ser combinado com tratamentos farmacológicos, ou manipulação transgênica de linhagens celulares específicas dentro da gônada. Usando essa técnica, temos imagens com sucesso dos passos da formação do nicho de células-tronco17. Essa abordagem de imagem é, portanto, fundamental para o campo da biologia das células-tronco, pois permitirá a visualização dos estágios iniciais de formação de nicho em tempo real dentro de seu ambiente natural15,17. Embora este método seja benéfico para o campo da biologia das células-tronco, é adicionalmente aplicável para visualizar quaisquer processos dinâmicos que ocorram na gônada durante este ponto de tempo de desenvolvimento, incluindo rearranjos celulares22, adesão celular 2,12,23 e migração celular23. Esse protocolo de dissecção aumentará assim nossa compreensão de muitos processos biológicos celulares fundamentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante a gonadogênese, a gônada embrionária, e particularmente o nicho de células-tronco dentro da gônada masculina15, sofre rápidas alterações morfológicas. Mecanismos de desenvolvimento que fundamentam essas mudanças dinâmicas são melhor compreendidos através de técnicas de imagem ao vivo. No entanto, no estágio 17 embrionário, a imagem in vivo da gônada torna-se impossível pelo início das contrações musculares em larga escala17. Com este pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui por suas contribuições substanciais para o desenvolvimento precoce deste protocolo. Os autores são gratos à comunidade de moscas por sua generosidade com reagentes, e particularmente a Ruth Lehmann e Benjamin Lin por seu dom da linha no5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ antes de sua publicação. Foram utilizados no estudo os estoques obtidos no Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabalho foi apoiado pelo NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D), bem como bolsas de treinamento T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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