Descrevemos a preparação de fitas de seções seriais e sua coleção em grande suporte de transferência para uso como amostras de tomografia de array, juntamente com procedimentos automatizados de imagem em um microscópio eletrônico de varredura. O protocolo permite a triagem, recuperação e imagens direcionadas de eventos locais, raros e a aquisição de grandes volumes de dados.
A microscopia eletrônica é aplicada em biologia e medicina para imagens de detalhes celulares e estruturais na resolução de nanômetros. Historicamente, a Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) forneceu uma visão da ultraestrutura celular, mas na última década, o desenvolvimento dos modernos microscópios eletrônicos de varredura (SEM) mudou a maneira de olhar dentro das células. Embora a resolução do TEM seja superior quando são necessários detalhes estruturais de nível proteico, a resolução sem é suficiente para a maioria das questões relacionadas à biologia celular de nível organela. O avanço da tecnologia possibilitou soluções automáticas de aquisição de volume, como imagem serial de face de bloco (SBF-SEM) e feixe de íons focados SEM (FIB-SEM). No entanto, até hoje, esses métodos permanecem ineficientes quando a identificação e navegação para áreas de interesse são cruciais. Sem os meios para localização precisa de áreas alvo antes da imagem, os operadores precisam adquirir muito mais dados do que precisam (na SBF-SEM), ou, pior ainda, preparar muitas grades e imagem de todas (no TEM). Propomos a estratégia de “triagem lateral” utilizando a Tomografia Matriz no SEM, que facilita a localização de áreas de interesse, seguida de imagem automatizada da fração relevante do volume total da amostra. Amostras de tomografia são conservadas durante a imagem, e podem ser organizadas em bibliotecas de seção prontas para imagens repetidas. Vários exemplos são mostrados em que a triagem lateral nos permite analisar detalhes estruturais que são incrivelmente desafiadores para acessar com qualquer outro método.
Apesar da importância das técnicas relacionadas ao EM, o esforço necessário para dominá-las mantém todo o campo restrito a um pequeno número de especialistas. Uma dificuldade significativa é a identificação e recuperação de uma Região de Interesse (ROI) nas amostras preservadas para EM. O aparecimento da mesma amostra difere consideravelmente quando analisado por microscopia óptica e após o processamento para observação EM. As alterações para amostras quimicamente preparadas incluem o encolhimento da amostra anisotropica após as etapas de desidratação (~10% em cada dimensão) e a perda de fluorescência ao usar o ósmio no protocolo de fixação e coloração(Figura 1A). Para a secção ultrathin, as amostras são incorporadas em resinas epóxi ou acrílicas utilizando diferentes estratégias(Figura 1B). Para resultados bem-sucedidos desta preparação, toda a amostra deve ser fracionada em pedaços que não excedam 1 mm x 1 mm. Para atender aos requisitos padrão das condições de observação da Microscopia eletrônica de Transmissão (TEM), esta pequena porção da amostra é ainda mais seccionada para fatias de 50-150 nm de espessura. As imagens resultantes em escala de cinza mostram a organização tecidual e a estrutura organela de uma fração minuciosa de toda a amostra em maior detalhe do que qualquer outra técnica de microscopia(Figura 1C). Um conjunto de dados tem típico fornece informações 2D, teoricamente extrapoladas para entender os processos que ocorrem naturalmente em um espaço 3D em células e tecidos. A Figura 1D apresenta o desafio da aquisição de volumes ultraestruturais: se um cubo de 1.000 μm lateral for seccionado com 50 nm de espessura, 20.000 seções serão necessárias para cobrir todo o volume; para um cubo lateral de 500 μm, serão 10.000 seções. Para cobrir um volume de 50 μm x 50 μm x 50 μm, 1.000 seções “apenas” podem ser necessárias. Obter esse volume manualmente é praticamente impossível e extremamente desafiador para realizar com automação. Se, além da profundidade da amostra, precisarmos cobrir toda a superfície desses cubos hipotéticos, a cobertura de 1 μm2 superfície em resolução razoável torna-se uma questão logística séria(Figura 1E). Embora para os projetos extraordinários em larga escala, como abordagens de connectômica, o grande número de seções é crucial, para a maioria dos projetos EM “mundanos”, gerar mais seções necessárias para a observação apresenta uma desvantagem significativa.
Existem vários métodos para adquirir informações ultraestruturais 3D: seção serial De Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), tomografia TEM, Tomografia de Array (AT), Microscopia eletrônica de varredura de imagens de bloco serial (SBF-SEM) e Microscopia eletrônica de varredura de feixe de íons focado (FIB-SEM). As principais diferenças entre esses métodos são a estratégia de secção e se a aquisição de imagem está acoplado à seção geração1. Na seção serial TEM, seções sequenciais são coletadas em grades de ranhura, imagens TEM são geradas a partir dessas sequências e alinhadas2,3,4,5. Na tomografia TEM, a série de inclinação de 150-300 nm seções em uma grade, e quando acoplado à seção serial, fornecem uma resolução muito alta, embora relativamente pequenos volumes6,7,8. A abordagem AT usa seção física com diversas formas manuais e semiautomáticas de seções de coleta em suporte relativamente grande, como tampas de vidro, wafers de silício ou uma fita especial. Para aquisição de imagens, o suporte é analisado no SEM, com diversas estratégias de aquisição de imagens disponíveis9,10,11,12,13,14,15 . Para a SBF-SEM, a secção física é realizada utilizando-se um mini-microtómeo com uma faca de diamante fixada diretamente dentro da câmara SEM, com a imagem SEM gerada a partir da superfície do bloco de resina16,17,18,19. Para o FIB-SEM, a fonte de íon remove camadas finas da amostra, seguida de imagem automática da superfície exposta pelo SEM20,21. A TEM-tomografia e o AT geram seções físicas, que podem ser reimagem, se necessário, enquanto FSBF-SEM e FIB-SEM eliminam a seção após a imagem. Uma combinação recente de seções físicas imagens por um SEM multi-feixe fornece uma combinação de métodos que resolve o problema do “gargalo” da velocidade de aquisição de imagem22. Cada uma dessas técnicas revolucionou a forma como os dados EM podem ser obtidos e analisados, e cada abordagem tem seus impactos práticos relacionados a uma determinada questão de pesquisa.
Dada a natureza da preparação e a escala das dimensões ultraestruturais, não é simples prever onde uma estrutura alvo específica está localizada no bloco amostral (Figure1D,E). Uma solução para a localização do ROI é gravar as imagens de todo o bloco na resolução desejada desde o início. As estruturas de interesse podem estar no volume de dados adquiridos quando longe do microscópio. O tempo de aquisição e o manuseio de dados associados a essa estratégia são problemáticos. É desejável reduzir a quantidade de dados registrados, especialmente se os ROIs forem muito menores do que o bloco tecidual, ou seja, se os objetos de interesse são tipos específicos de células (não órgãos inteiros). Diferentes técnicas correlativas de luz e microscopia eletrônica (CLEM) podem ser bem sucedidas quando a fluorescência for preservada e localizada antes ou depois da preparação dentro da mesma amostra23,24,25,26,27,28,29. No entanto, muitas estruturas celulares são reconhecíveis mesmo sem correlação de fluorescência, apenas com base na ultraestrutura conhecida. Para esses casos, acreditamos que a tomografia do Array de triagem lateral proporciona uma troca de equilíbrio entre o esforço investido na localização do ROI e a qualidade da informação ultraestrutural. Usando essa estratégia, um subcontrato de seções no wafer é exibido dentro de intervalos regulares, que podem ser estabelecidos com base no tamanho e natureza do ROI. Uma vez encontradas ROIs, a aquisição de dados é configurada em uma série contínua de seções que começam antes e terminam após a seção âncora, coletando as informações relevantes de forma direcionada.
Apresentamos protocolos para AT que simplificam e aceleram a aquisição de regiões ou eventos de interesse em inúmeras seções e produzem volumes de imagem mais alinhados. A triagem lateral e a aquisição de várias etapas produzem dados com resolução muito alta em regiões precisamente visadas. O procedimento que descrevemos aborda vários desafios da aquisição de dados 3D EM, como prevê: compatibilidade com uma ampla gama de espécimes sem alterar fundamentalmente o fluxo de trabalho de preparação da amostra; localização direcionada para secção e aquisições de SEM; tempo e esforço reduzidos durante a configuração; imagem de regiões em múltiplas seções com melhor alinhamento dos volumes resultantes; e um procedimento de costura e alinhamento suave para compilar diferentes imagens em uma imagem de mosaico costurada. Optamos por demonstrar a força do nosso método com várias amostras de projetos publicados e em andamento. Acreditamos que essa abordagem pode facilitar significativamente a geração e aquisição de dados EM direcionados, mesmo para pesquisadores com experiência em EM limitada.
A microscopia eletrônica dá uma visão da ultraestrutura das células e organismos, para as quais muitas vezes é desejável imagens de estruturas de interesse em seu contexto tridimensional. Apesar de inúmeras táticas EM para análise ultraestrutural, ainda não há uma solução “padrão-ouro”. A principal razão é a grande variedade de amostras, muitas questões biológicas, que frequentemente requerem uma abordagem personalizada. O fluxo de trabalho AT proposto foi projetado para minimizar o tempo necessário para processamento de amostras, aquisição de dados, avaliação e armazenamento. Além disso, a faca modificada fornece uma ferramenta útil para simplificar a aquisição de arrays. O layout compacto de seções em wafers é conveniente, tanto para a observação quanto para o armazenamento subsequente das amostras. Este arranjo permite a “Triagem Lateral” das amostras movendo-se horizontalmente da fita para a fita e escaneando apenas uma seção em cada uma, reduzindo significativamente o tempo necessário para localização de um ROI. Os cenários propostos de aquisição de dados facilitam o direcionamento de áreas pequenas e distribuídas aleatoriamente. Uma vez encontrado, a AT/SEM restringe a imagem de alta resolução precisamente ao volume de juros, seja realizada manualmente ou com a ajuda da função automática. AT para volumes limitados pode ser concluído manualmente, com o operador navegando através da amostra e definindo regiões de imagem um a um. O módulo automatizado do software fornece uma estratégia flexível de aquisição de imagens para imagens de pequenas áreas em grandes seções. A automação neste software permite gravar grandes imagens de alta resolução em centenas de seções, alcançando volumes semelhantes aos SBFI. A gravação de imagens de visão geral de todas as seções simplifica a localização do ROI e reduz o tempo gasto no microscópio. Uma vez que as seções não são prejudicadas durante o registro de visões gerais e visualizações de resolução mais alta, a AT/SEM permite reutilizar a amostra para coletar dados adicionais de outros ROIs ou em uma resolução mais alta.
O tempo de aquisição de imagens é um dos aspectos mais importantes (e mais caros) do EM 3D e, portanto, deve ser considerado no design do experimento. Embora não seja surpreendente que a imagem de grandes áreas deva mais tempo do que a imagem de pequenas áreas, é fácil subestimar o impacto: Dependendo dos parâmetros de imagem selecionados, o tempo de aquisição em cada seção pode variar de segundos a horas. Os parâmetros críticos de imagem incluem o tamanho do campo de visão, resolução e tempo de moradia. Assumindo uma resolução de destino de 10nm por pixel e 1 μs de tempo de moradia, a imagem de um campo de 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm, ou 500 μm x500 μm leva 4 segundos, 100 segundos ou 2.500 s para gravar. Podemos multiplicar esses tempos de imagem por seção pelo número de seções para estimar o tempo necessário para o trabalho completo de imagem. Longos tempos de imagem por seção podem ser aceitáveis se o número de seções for pequeno ou se o tempo da ferramenta do microscópio não for de nenhuma preocupação.
No entanto, é necessário limitar o tempo de gravação a um trabalho noturno ou a um trabalho de fim de semana na maioria dos casos. Um aspecto igualmente crítico do EM 3D que deve ser considerado, é a quantidade e a estrutura dos dados de imagem resultantes. O registro dos campos de imagem acima mencionados em 100 seções gera 400 mb, 10 gb ou 250 gb de dados de imagem, respectivamente; as imagens de 500 μm x 500 μm representam a questão adicional de ser maior que 2 gb cada. Muitos dos programas de software usados para avaliação de dados não podem abrir imagens deste tamanho.
Para reduzir o tempo de imagem, é importante escolher o tempo de moradia do pixel para atender aos requisitos da relação sinal-ruído para a avaliação de dados subsequente (por exemplo, reconstrução, rastreamento) e limitar as gravações a ROIs definidas. A extensão AT do software facilita a aquisição de imagens em pequenas áreas em seções seriais. O software suporta fluxos de trabalho manuais e automáticos e muitas variantes semiautomáticas: as áreas de imagem podem ser posicionadas manualmente e focadas em cada seção, ou o usuário pode usar os recursos automáticos de localizador de seção e alinhamento de posição. Dependendo do nível de automação escolhido e suportado pelo tipo de amostra ou metas de imagem, o tempo necessário para configurar a aquisição de imagens em centenas de seções pode levar um dia de trabalho inteiro (feito manualmente) ou apenas alguns minutos. Em princípio, a Tomografia Array torna mais desafiador do que outros métodos EM 3D para adquirir pequenos ROIs; a colocação imprecisa da região em seções consecutivas deve ser compensada pela aquisição de áreas maiores. Por exemplo, se o ROI tiver 20 μm x 20 μm de tamanho e a variabilidade de posição de seção para seção dos campos de imagem for de 10μm, é preciso adquirir imagens de 40 μm x 40 μm para ter certeza de que o ROI está totalmente capturado em cada imagem, em cada seção. A variabilidade da posição de imagem do mundo real varia de 100 μm a < 10 μm, dependendo da disponibilidade ou qualidade dos recursos de software para alinhamento de posição ou paciência do usuário. Com este software, 10 μm podem ser alcançados sem muita intervenção manual na maioria das amostras.
Como qualquer técnica, o AT tem vários pontos fracos que podem influenciar a aquisição bem-sucedida de dados, e muitos são semelhantes a outros métodos baseados em secções. A falta de distribuição homogênea de resina vazia versus tecido pode resultar em matrizes curvas ou quebradas. Em casos extremos, as seções podem se desvincular do suporte(Figura 6A). A compressão variável ou alongamento durante o processo de corte pode criar dobras que podem interromper a amostra em regiões variáveis em seções subsequentes(Figura 6B). Marcas de faca podem aparecer na superfície das seções coletadas usando uma faca danificada(Figura 6C). Diferenças nas condições de secção podem induzir diferenças ocasionais de compressão e espessura da seção. Partículas de poeira ou sujeira podem pousar em uma seção e obscurecer parcialmente a zona de interesse(Figura 6D). A aquisição de imagens pode falhar devido a funções imperfeitas de auto-contraste, foco automático e auto-estigmator. O posicionamento de áreas de imagem criadas automaticamente pode ser variável e pode não capturar o ROI em todas as seções.
Vários problemas podem surgir na fase de costura e alinhamento. A costura automática de aquisições de telhas de mosaico pode falhar, por exemplo, por causa do grande espaço vazio dentro da amostra. Devido a uma mudança drástica de forma em 3D, pilhas de imagens podem ser desafiadoras para registrar. Programas especialmente desenvolvidos (por exemplo, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB ou MAPS-AT) podem facilitar o alinhamento semiautomático32,38,39,40. Seções mais desafiadoras podem ser alinhadas manualmente usando software de edição de fotos. Infelizmente, alguns conjuntos de dados podem ser impossíveis de alinhar corretamente.
Grandes amostras são desafiadoras para seções seriais TEM que se encaixam em grades; por outro lado, muitos projetos não justificam a aquisição automática de longa duração utilizando a FIB/SEM ou a SBF-SEM. O AT é uma alternativa simples a uma seção serial tediosa TEM onde a coleta e manipulação de seções seriais em um wafer são mais simples do que com as grades de ranhura. Várias estratégias foram desenvolvidas para facilitar a coleta das matrizes, e compartilhamos nosso método para expandir o kit de ferramentas existente. Nos casos em que a identificação do ROI é desafiadora, o AT-SEM oferece uma vantagem fundamental, com a triagem eficiente das amostras em que a resolução em escala de organela em 50 a 500 seções é necessária. Para volumes maiores, as estratégias AT de coleta automática podem ser coletadas de forma eficiente se forem necessárias mais seções. As amostras AT podem ser reimagem várias vezes, facilitando imagens direcionadas de áreas de alta resolução com base em imagens de visão geral adquiridas anteriormente. Acreditamos que a análise direcionada e a redução do excesso de preços pela AT/SEM proposta aqui diminui os requisitos de mão-de-obra e armazenamento de dados. Em última análise, bibliotecas de seções podem ser coletadas e mantidas para posterior reutilização e consulta. Para aquisição de volume, as abordagens FIB ou SBF-SEM oferecem uma excelente solução sempre que o ROI é fácil de identificar na face do bloco ou se grandes volumes 3D são necessários para a análise. No entanto, o FIB/SBF-SEM é menos eficiente quando a imagem de pilha de alta resolução deve ser coletada de um ROI definido de forma direcionada. Para concluir, os métodos propostos para triagem de amostras AT e o uso de imagens de visão geral de resolução média permitem limitar a aquisição de imagens às partes relevantes do array de seção. O objetivo preciso das regiões de imagem acelera o tempo de dados e simplifica a avaliação dos dados.
Em resumo, embora o conceito de AT/SEM não seja novo, seu uso ainda não é tão difundido quanto seus méritos sugerem. No geral, fornece um procedimento complementar a outros métodos EM existentes. O AT/SEM é compatível com a mais ampla gama de protocolos de preparação de amostras e fluxos de trabalho de imagem e pode ser feito em qualquer microscópio FIB/SEM ou SBF-SEM como técnica de acompanhamento. Neste artigo, concentramos-nos no AT para o registro de dados ultraestruturais de amostras menos propensas a serem tratadas com sucesso por outros métodos. Esperamos que o procedimento descrito para a coleta conveniente de seções e estratégias de aquisição consideravelmente automatizadas ajude nas primeiras tentativas para aqueles que nunca encontraram o método e ajude a aperfeiçoá-lo para aqueles que já têm alguma experiência.
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer aos membros da unidade EM da Universidade de Lausanne pelo apoio durante este desenvolvimento de diferentes etapas do procedimento AT. Gostaríamos de agradecer a Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O’Brien e Lindsay Lewellyn pelas discussões durante a preparação do manuscrito e leitura crítica. Queremos reconhecer os grupos que contribuíram com as amostras usadas para demonstrar os diferentes cenários: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat e Fanny Langlet.
Cutting | |||
AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
Image acquisition | |||
FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
Image analysis | |||
Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |