Het voeden en kwantificeren van dierlijk bloed en kunstmatige maaltijden in Aedes aegypti-muggen

Bloedtoevoerprocedures werden niet uitgevoerd met levende dieren of menselijke gastheren en voldeden aan de richtlijnen van de Rockefeller University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en Institutional Review Board (IRB). 1. Maaltijdbereiding Bereiding van het fagostimulant, adenosine 5′-trifosfaat Bereid een 25 mM oplossing van waterige NaHCO3 (molecuulgewicht, MW = 84.006 g/mol). Voeg voor 100 ml van 25 mM NaHCO3210 mg NaHCO3 toe aan een volumetrische kolf en vul met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een totaal volume van 100 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle NaHCO3 is opgelost. Reconstitueer ATP-dinatriumzouthydraat (MW = 551,14 g/mol) in het waterige 25 mM NaHCO3 tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM ATP. Voeg voor een totaal volume van 10 ml atp van 200 mM in 25 mM NaHCO3-buffer 1,1 g ATP-dinatriumzouthydraat toe aan een volumetrische kolf en vul met 25 mM NaHCO3-buffer tot een totaal volume van 10 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle ATP is opgelost.OPMERKING: Om hydrolyse van ATP te minimaliseren, moet het worden gebufferd door een zoutoplossing zoals NaHCO3. Aliquot de ATP-oplossing en bewaren bij -20 °C.OPMERKING: Deze voorraadoplossing van ATP wordt meestal om de zes maanden vers gemaakt en wordt gebruikt voor alle hieronder beschreven maaltijden. Om afbraak te voorkomen, mogen ATP-aliquots niet meerdere vriesdooicycli ondergaan of samen met andere maaltijdcomponenten worden verwarmd. Bereiding van de fluorescerende traceroplossing, fluoresceïne Bereid een 2% (w/v) voorraadoplossing van waterige fluoresceïne. Meng voor een totaal voorraadoplossingsvolume van 10 ml 0,2 g fluoresceïne dinatriumzout met 10 ml ddH2O in een conische buis van 15 ml die bij kamertemperatuur in aluminiumfolie is gewikkeld. Deze voorraadoplossing fluoresceïne kan worden gebruikt voor verdunning in alle hieronder beschreven maaltijden.OPMERKING: Omdat fluoresceïne lichtgevoelig is, vermijd blootstelling aan licht door containers in aluminiumfolie te wikkelen. Bereiding van van dieren afgeleide bloedmaaltijden Bereken het aantal maaltijden dat nodig is om alle muggen te voeden; elke Glytube bevat een maaltijd van 2 ml en voedt ongeveer 25 muggen. Bereid nog een maaltijd om de standaardcurve voor fluorescentiemetingen te kalibreren. Tenzij anders vermeld, beschrijven alle stappen in deze sectie reagenshoeveelheden die nodig zijn om één maaltijd met een eindvolume van 2 ml te bereiden. Breng voor van dieren afgeleide bloedmaaltijden 1,98–2 ml gedefibrineerd schapenbloed over in een conische buis van 15 ml (zie stap 3.3 voor het gewenste bloedvolume).OPMERKING: Commercieel gedefibrineerde bronnen van gewerveld bloed, waaronder van schapen, cavia’s en mensen, mogen worden gebruikt13. Zorg er voor gebruik voor dat het gekochte bloed de vervaldatum niet heeft overschreden en meng het goed door de fles om te wenden, vooral als er zichtbare scheiding van bloedbestanddelen is. Voeg voor een optimale voeding ATP toe aan een uiteindelijke concentratie van 1-2 mM nadat het schapenbloed is opgewarmd tot 45 °C in een waterbad. Voeg voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM ATP 10 μL van de ATP-voorraadoplossing van 200 mM toe aan 1,99 ml voorverwarmd bloed en meng. Voeg voor een uiteindelijke concentratie van 2 mM ATP 20 μL van de ATP-voorraad van 200 mM toe aan 1,98 ml voorverwarmd bloed en meng. Als ATP niet mag worden toegevoegd, verwarm dan 2 ml gedefibrineerd schapenbloed. Als vervolgens op fluorescentie gebaseerde kwantificering van de meelgrootte moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïneoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,002% (2 μL van 2% fluoresceïnevoorraad in 2 ml totaal meelvolume). Verminder het bloedvolume met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne. Behoud 1 ml van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentiestandaardcurve te genereren. Behandel het vastgehouden volume identiek aan de maaltijd die aan muggen wordt geleverd; gedurende de hele duur van het experiment blootstellen aan dezelfde licht- en temperatuuromstandigheden en dit vervolgens samen met de geleverde maaltijd invriezen. Bereiding van kunstmatige bloedmaaltijden Bereken het aantal maaltijden dat nodig is om alle muggen te voeden; elke Glytube bevat een maaltijd van 2 ml en voedt ongeveer 25 muggen. Bereid nog een maaltijd om de standaardcurve voor fluorescentiemetingen te kalibreren. Tenzij anders vermeld, beschrijven alle stappen in deze sectie reagenshoeveelheden die nodig zijn om één maaltijd van 2 ml te bereiden. Maak voor de bereiding van kunstmatig bloed (aangepast aan Kogan (1990)22), zoals in tabel 1,eerst een voorraadoplossing van 400 mM NaHCO3. Voeg voor een totaal volume van 10 ml van 400 mM NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol) 336 mg NaHCO3 toe aan een volumetrische kolf en vul met dubbel gedestilleerd water (ddH2O) tot een totaal volume van 10 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle NaHCO3 is opgelost. Bereid voor de eiwitcomponenten van kunstmatig bloed voorraadoplossingen van 50 mg/ml γ-globulinen in 400 mM NaHCO3,35 mg/ml hemoglobine in ddH2O en 300 mg/ml albumine in ddH2O. Eiwitvoorraadoplossingen kunnen tot 2 maanden bij 4 °C worden bewaard. De uiteindelijke concentratie van totale menselijke eiwitten in kunstmatig bloed is 125 mg/ml. Dit omvat eindconcentraties van 15 mg/ml γ-globulines, 8 mg/ml hemoglobine en 102 mg/ml albumine. Combineer voor elke maaltijd van 2 ml 600 μL γ-globulines, 460 μL hemoglobine, 680 μL albumine en 250 μL ddH2O uit de in tabel 1vermelde voorraadoplossingen . Wacht met het toevoegen van 10 μL atp-voorraadoplossing van 200 mM tot na de maaltijd is opgewarmd tot 45 °C, onmiddellijk voordat u de maaltijd presenteert. Als vervolgens op fluorescentie gebaseerde kwantificering van de meelgrootte moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïneoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,002% (2 μL van 2% fluoresceïnevoorraad in 2 ml totaal meelvolume). Verminder het volume van ddH2O in stap 4.4 met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne. Behoud ten minste 1 ml van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentiestandaardcurve te genereren. Behandel het vastgehouden volume identiek aan de maaltijd die aan muggen wordt geleverd; gedurende de hele duur van het experiment blootstellen aan dezelfde licht- en temperatuuromstandigheden en dit vervolgens samen met de geleverde maaltijd invriezen. Bereiding van voorbeeld eiwitvrije zoutoplossingsmaaltijden (aangepast van Duvall et al. (2019)7)OPMERKING: Eiwitvrije zoutmaaltijden kunnen op meerdere manieren worden bereid7,27,32. De zoutoplossingmaaltijd die hier wordt gepresenteerd, is een eiwitvrije versie van het hierboven beschreven kunstmatige bloedrecept. Bereken het aantal maaltijden dat nodig is om alle muggen te voeden; elke Glytube bevat een maaltijd van 2 ml en voedt ongeveer 25 muggen Bereid een extra maaltijd voor om de standaardcurve voor fluorescentiemetingen te kalibreren. Tenzij anders vermeld, beschrijven alle stappen in deze sectie reagenshoeveelheden die nodig zijn om één maaltijd van 2 ml te bereiden. Om de zoutoplossing te bereiden, maakt u een voorraadoplossing van 400 mM NaHCO3. Voeg voor een totaal volume van 10 ml van 400 mM NaHCO3 (MW = 84.006 g/mol) 336 mg NaHCO3 toe aan een volumetrische kolf en vul met ddH2O tot een totaal volume van 10 ml. Meng de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf grondig totdat alle NaHCO3 is opgelost. Combineer voor elke maaltijd van 2 ml in een conische buis van 15 ml 600 μL van 400 mM NaHCO3 met 1,39 ml ddH2O. Wacht met het toevoegen van 10 μL van de ATP-voorraadoplossing van 200 mM totdat de maaltijd is opgewarmd tot 45 °C in een waterbad. Als vervolgens op fluorescentie gebaseerde kwantificering van de meelgrootte moet worden uitgevoerd, voegt u fluoresceïneoplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 0,002% (2 μL van 2% fluoresceïnevoorraad in 2 ml van het totale maaltijdvolume). Verminder het volume van ddH2O in stap 5.3 met dezelfde hoeveelheid als de toegevoegde fluoresceïne. Behoud ten minste 1 ml van de uiteindelijke maaltijdformulering die 0,002% fluoresceïne bevat om de referentiestandaardcurve te genereren. Behandel het vastgehouden volume identiek aan de maaltijd die aan muggen wordt geleverd; gedurende de hele duur van het experiment blootstellen aan dezelfde licht- en temperatuuromstandigheden en dit vervolgens samen met de geleverde maaltijd invriezen. 2. Maaltijdbezorging aan muggen Het opzetten van muggencontainers voor het voedenOPMERKING: Muggen kunnen in verschillende containers worden gevoerd zolang aan de volgende criteria is voldaan. Zorg ervoor dat de container groot genoeg is voor muggen om in rond te vliegen, maar niet zo groot dat het moeilijk zal zijn voor de muggen om het gaasoppervlak te lokaliseren en te beginnen met voeden. Het gaas dat wordt gebruikt om de container te bedekken, kan variëren in materiaal en gatgrootte. De gaten moeten groot genoeg zijn om de stijl van de vrouwelijke mug door te prikken, maar niet zo groot dat de mug kan ontsnappen. Bevestig het gaas stevig zodat het strak zit en de Glytube gedurende de voedingsperiode stabiel op het oppervlak kan rusten. Een voorbeeldcontainer (figuur 1) is een gemodificeerde plastic emmer van 946 ml (32 oz) met hoge dichtheid polyethyleen (HDPE). Om deze opstelling te repliceren, gebruikt u een scheermesje om een centraal gat van ~ 10 cm diameter in het deksel van de emmer te snijden. Om de container voor gebruik door muggen te monteren, bevestigt u een ~ 400 cm2 vierkant stuk witte 0,8 mm polyester muskietengaas bovenop de emmer en duwt u het geperforeerde deksel er stevig overheen om stevig te breken. Verzamel vrouwelijke muggen die ten minste 3 dagen na de eclosie zijn om ervoor te zorgen dat ze volwassen genoeg zijn om bloed te geven. Optimale voedingssnelheden worden waargenomen na 7 dagen33. Plaats vrouwelijke muggen in de container en dek af met gaas. Als de container dichtbevolkt is met muggen, verhoog dan het aantal Glytubes dat wordt gebruikt. Optimale voeding wordt bereikt met ~25 muggen/Glytube. Dit vermindert de concurrentie voor toegang tot het voedingsmembraan. Zet een controlegroep van ongefeerde muggen opzij die geen maaltijd wordt aangeboden. Weeg in het gewichtsmeetprotocol de niet-gefed groep afzonderlijk en gebruik dit gewicht om gewichtstoename te schatten in de experimentele groep die zich voedde met een maaltijd. Voeg in het op fluorescentie gebaseerde kwantificeringsprotocol de niet-gefeerde groep muggen toe aan de putten voor de standaardcurveberekeningen en voor negatieve controles. Om de automatische fluorescentie van muggenweefsel in de experimentele groep aan te passen, moet u ervoor zorgen dat de standaardcurve en negatieve controleputten een niet-gefeerde mug bevatten. Bouwen en opzetten van de Glytube (aangepast aan Costa-da-Silva et al. (2013)20) Zoals afgebeeld in figuur 1, om een warmtebron te genereren, vul een conische buis van 50 ml met 40 ml 100% glycerol. Sluit de open conische buis af met een 5 cm × 5 cm stuk parafilm en herhaal dit met een extra stuk van 5 cm × 5 cm parafilm om de kans op lekkage te minimaliseren. Optioneel kan de parafilm op zijn plaats worden gehouden met behulp van elastiekjes. Omk de buis om ervoor te zorgen dat er geen gaten of openingen zijn. Om het maaltijdbezorgapparaat te maken, snijdt u een gecentreerd gat met een diameter van 2,5 cm in de schroefdop van de conische buis met behulp van een scherp scheermesje of, voor een betere consistentie, een draaibank. Strek een stuk parafilm van 5 cm × 5 cm gelijkmatig, zodat het ongeveer verdubbelt in grootte. De parafilm moet dun genoeg zijn dat muggen er gemakkelijk doorheen kunnen prikken, maar er mogen geen lekken zijn. Sluit af over het buitenoppervlak van de schroefdop om het gat volledig te bedekken en zet de dop opzij.OPMERKING: Om de aantrekkingskracht op de Glytube te vergroten, voordat u de parafilm uitrekt, parfumeert u deze met menselijke geur door deze voorzichtig op een stukje menselijke huid te wrijven zonder cosmetica aan te brengen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen gaten worden gemaakt. Dit wordt aanbevolen als het experiment niet gericht is op het onderzoeken van de zintuiglijke signalen die nodig zijn voor muggen om de maaltijd te benaderen. Verwarm zowel de verzegelde tube glycerol als de maaltijd (met alle componenten behalve ATP) gedurende ten minste 15 minuten in een waterbad van 42-45 °C. Verwarm ATP niet voor; voeg het onmiddellijk toe voordat u met het experiment begint. Voeg ATP toe aan de opgewarmde maaltijd en vortex grondig. Pipet 2 ml van de verwarmde maaltijd in de binnenkamer van de schroefdop en plaats er voorzichtig de omgekeerde, verwarmde, met glycerol gevulde conische buis van 50 ml in. Schroef de dop gedeeltelijk met de maaltijd op de met glycerol gevulde buis – net genoeg om lekkage van de maaltijd of de glycerol te voorkomen.OPMERKING: Het gebruikte maaltijdvolume kan variëren tussen 1 ml en 2,5 ml. Lagere volumes kunnen vooral nuttig zijn wanneer maaltijden worden gebruikt om verbindingen te leveren die schaars of duur zijn. Het is belangrijk om snel te werken bij deze stap, zodat de maaltijd niet afkoelt tot omgevingstemperatuur en de kans op maximale voeding vermindert. De snelheid van koeling is afhankelijk van de omgevingstemperatuur van de ruimte waar deze stappen worden uitgevoerd, maar ze moeten meestal binnen 5 minuten bij 25 °C worden voltooid. Plaats de geassembleerde Glytube op de muggencontainer en geef de muggen minstens 15 minuten toegang tot voer om maximale voedersnelheden te bereiken. Voor een optimale voeding plaatst u muggencontainers in een kamer die is uitgerust met een CO2-pad en laat u ten minste 15 minuten acclimatiseren bij 25-28 °C en 70-80% luchtvochtigheid voordat u de maaltijd aflevert. De hier gebruikte testkamer is een eenvoudige en goedkope wijziging van een eerder gepubliceerde opstelling16. Het maakt gebruik van een doorschijnende polypropyleen opbergdoos van maat 36 cm L × 31 cm B × 32 cm H met een afneembaar deksel. Een gat met een diameter van 1,5 cm in de kamerwand maakt co2-levering door siliconen buizen mogelijk. De CO2 diffusie pad wordt aangebracht op het binnenste midden van het deksel voor de levering van gezuiverde lucht en CO2 om de kameratmosfeer tijdens de proef te conditioneren.OPMERKING: Zorg ervoor dat gastheersignalen (warmte en CO2, met optionele gastheergeur16) aanwezig zijn, zodat de muggen worden aangetrokken door de membraanaanvoer. Als muggen niet onder de Glytube verdringen, controleer dan of CO2 goed wordt geleverd en of de maaltijd en Glytube voldoende warm zijn. Als er geen externe CO2-bron beschikbaar is, kan CO2 worden geleverd via rookwolken van uitgeademde menselijke adem. Na het voeren kan de Glytube-dop worden weggegooid als biogevaarlijk afval of worden hergebruikt na weken in een bleekoplossing met een laag percentage en grondig spoelen in water. 3. Kwantificering van geconsumeerde maaltijden Wegen van muggen die moeten worden gebruikt voor verdere experimentenOPMERKING: Door muggen te wegen om de grootte van de maaltijd te kwantificeren, kunnen ze worden gebruikt voor verdere live experimenten, maar deze methode vereist het nemen van gewichtsmetingen van een groep van 5 muggen. Omdat gewichten van individuele muggen moeilijk nauwkeurig te meten zijn met behulp van de meeste laboratoriumbalansen, kan variabiliteit in individuele meelgrootte niet gemakkelijk worden gekwantificeerd door gewichten te meten. Wegen wordt alleen aanbevolen voor situaties waarin vrouwtjes zichtbaar op de maaltijd engorge. Verdoof muggen door hun container naar een koude ruimte van 4 °C te verplaatsen of op ijs te plaatsen. Weeg groepen van 5 vrouwtjes uit het niet-gefed cohort (d.w.z. muggen die nooit een maaltijd werden aangeboden) en bereken hun gemiddelde gewicht als de schatting van het “pre-feeding” gewicht. Het gemiddelde gewicht van een niet-gefed mug hangt af van genotypen, geslacht en opfokomstandigheden. Unfed vrouwelijke Ae. aegypti muggen gekweekt met ad libitum toegang tot sacharose wegen meestal ongeveer 2 mg per stuk. Van het experimentele cohort (d.w.z. muggen die een maaltijd kregen aangeboden), sorteer vrouwtjes in “gevoede” en “niet gevoede” stapels op basis van de opgezette buik waarneembaar door oog7. Verdeel elk van de “gevoede” en “niet gevoede” stapels respectievelijk in groepen van 5 muggen om te wegen. Muggen binnen elke groep van 5 moeten worden afgeleid van hetzelfde experimentele cohort voor het uitvoeren van groepsgewichtmetingen. Bereken het gemiddelde gewicht per vrouw van elk van de “gevoede” en “niet gevoede” stapels van de experimentele groep. Fluorescentiemeting voor eindpuntanalyse7,27,34OPMERKING: Om nauwkeurige maaltijdgroottemetingen te verkrijgen van individuele muggen die niet langer nodig zijn voor verdere live experimenten, bewaart u de muggen en de resterende 1 ml meel met 0,002% fluoresceïne bij -20 °C onmiddellijk na het voeren. Het experiment kan hier worden gepauzeerd. Deze methode wordt beschreven in Figuur 2.Om een referentiestandaardcurve te genereren, bereidt u een seriële verdunning van hetzelfde meel met 0,002% fluoresceïne dat werd aangeboden aan de experimentele groep muggen. Er komen in totaal 8 standaard curve oplossingen. In elk van deze oplossingen zal het uiteindelijke volume meel met 0,002% fluoresceïne 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625, 0,078125 of 0 μL, en elk in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor een totaal volume van 100 μL (bijv. 5 μL meel met 0,002% fluoresceïne in 95 μL van 1x PBS). Om de eerste oplossing van de standaardcurve te maken, voegt u 50 μL meel met 0,002% fluoresceïne tot 950 μL 1x PBS en vortex grondig toe (eindvolume: 5 μL meel met 0,002% fluoresceïne in 95 μL 1x PBS). Om de rest van de standaard curve-oplossingen te maken, voert u voor elke stap een 2-voudige verdunning uit door 500 μL van de vorige buis te nemen en deze toe te voegen aan een nieuwe buis met 500 μL 1x PBS. Vortex ruim voor het voorbereiden van de volgende 2-voudige verdunning. Om putten voor te bereiden die moeten worden gebruikt voor het genereren van een referentiestandaardcurve, pipetteert u 100 μL van elk van de standaardcurveoplossingen in elk van de 8 putten in de eerste kolom van een PCR-plaat met 96 putten. Voeg 1 niet-gefed bestrijdingsmug toe aan elk van dezelfde 8 putten in de eerste kolom van de plaat. Herhaal dit in de tweede kolom van de plaat voor een repliceermeting.OPMERKING: Als experimentele groepen verschillende maaltijdtypen worden aangeboden, moet voor elk maaltijdtype een afzonderlijke referentiestandaardcurve worden bereid. Voeg 100 μL 1x PBS toe aan elke resterende put voor de niet-gefed controle- en experimentele groepen. Als het weefsel in de volgende stappen moet worden verstoord met behulp van een parelmolenhomogenisator of vortex, voeg dan aan elke put een borosilicaat massief glaskraal van 3 mm toe. Voeg als negatieve controle 1 ongefeerde mug toe aan elke put in de volgende 2 kolommen van de plaat. De fluorescentie gemeten in deze groep stelt een baseline cutoff in om rekening te houden met weefsel autofluorescentie en zal worden gebruikt om te bepalen of een mug in de experimentele groep gevoed met de maaltijd. Voeg 1 mug per put toe aan de resterende putten van de experimentele groepen die een maaltijd kregen aangeboden. Sluit de plaat zorgvuldig af en verstoort het weefsel door handmatig te slijpen. De buik moet grondig worden gehomogeniseerd om het meel vrij te geven. Methoden om weefsel te verstoren zijn onder meer het gebruik van een parelmolenhomogenisator met 3 mm borosilicaat massiefglasparels (30 Hz gedurende 30 seconden), vortexmixer met 3 mm borosilicaat massiefglas kralen of een stampermolen zonder kralen. Centrifugeer de plaat bij 2000 tpm gedurende 1-2 minuten om het lysaat te verzamelen. Bereid een zwarte plaat van 96 putten met 180 μL 1x PBS in elke put. Breng 20 μL lysaat over naar elke put met 180 μL 1x PBS en meng. Gebruik indien beschikbaar een meerkanaals pipet in deze stap voor een hogere snelheid en een betere consistentie. Meet de fluorescentie-intensiteit van elke put met behulp van een plaatlezer op het 485/520 excitatie/emissiekanaal. Genereer de referentiestandaardcurve door het bekende maaltijdvolume te plotten op basis van de overeenkomstige fluorescentie-intensiteitsmeting. Extrapoleer met behulp van de gegenereerde referentiestandaardcurve het maaltijdvolume dat door elk van de experimentele groepsmuggen wordt ingenomen. Trek de gemiddelde fluorescentie-intensiteitsmeting van de negatieve controlegroep van niet-gefeerde muggen af van de fluorescentie-intensiteitsmeting van elk experimenteel groep individu om te corrigeren voor autofluorescentie van het basisweefsel.