JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

Published: January 27, 2021
doi:
10.3791/61808
, , , , ,
1College of Veterinary Medicine,Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Beijing Agricultural Vocational College

Summary

Küçük bir kodlamayan RNA micC’nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.

Abstract

Kodlamayan küçük RNA (sRNA), transkripsiyon sonrası düzeyde gen ekspresyonunu düzenlemek için yeni bir faktördür. Escherichia coli ve Salmonella Typhimurium’da bilinen bir tür sRNA MicC, dış zar proteinlerinin ekspresyonunu baskılayabilir. Salmonella Enteritidis’te micC’nin regülasyon fonksiyonunu daha fazla araştırmak için, Salmonella Enteritidis suşu 50336’daki micC genini klonladık ve daha sonra λ Kırmızı bazlı rekombinasyon sistemi ve mikC eksprese eden rekombinant plazmid pBR322 taşıyan tamamlanmış mutant 50336Δ micC / p micC ile mutant 50336Δ micC / p micC oluşturduk. qRT-PCR sonuçları, 50336Δ micC’de ompD’nin transkripsiyonunun vahşi tip suşa göre 1.3 kat daha yüksek olduğunu, 50336Δ micC’de ompA ve ompC’nin transkripsiyonunun ise vahşi tip suştakilere göre 2.2 kat ve 3 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bunlar, micC’nin ompA ve ompC ekspresyonunu bastırdığını göstermiştir. Aşağıdaki çalışmada, 50336ΔmicC’nin patojenitesi, hem 6 haftalık Balb / c farelerini hem de 1 günlük tavukları enfekte ederek tespit edildi. Sonuç, 6 haftalık Balb / c fareler için vahşi tip suş 50336’nın LD 50’sinin, mutantların 50336ΔmicC ve 50336Δ micC / pmicC’nin sırasıyla 12.59 CFU, 5.01 CFU ve 19.95 CFU olduğunu göstermiştir. 1 günlük tavuklar için suşların LD 50’si sırasıyla 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU ve2.54 x 10 8 CFU idi. MicC’nin silinmesinin S’nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Enteritidis, farelerde ve tavuklarda dış zar proteinlerinin ekspresyonunu düzenleyerek.

Introduction

Kodlamayan küçük RNA’lar (sRNA’lar), genellikle proteinleri kodlamayan, ancak bakteri kromozomları 1,2,3’te bağımsız olarak kopyalanabilen 40-400 nükleotid uzunluğundadır. Çoğu sRNA, gen kodlayan bölgeler arasındaki intergenik bölgelerde (IGR’ler) kodlanır ve baz eşleştirme eylemleri yoluyla hedef mRNA’larla etkileşime girer ve hedef genlerin ekspresyonunu transkripsiyon sonrasıseviye 4,5’te düzenler. Madde metabolizmasında, dış membran protein sentezinde, çekirdek algılamada ve virülans gen ekspresyonunda önemli regülasyon rolleri oynarlar5.

MicC, Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium’da bulunan ve OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ve Omp36 6,7,8,9 gibi çoklu dış zar protein ekspresyonunu düzenleyebilen 109 nükleotid küçük RNA transkriptidir. MicC, in vitro ompC mRNA liderine ribozom bağlanmasını inhibe ederek OmpC ekspresyonunu düzenler ve Escherichia coli6’daki işlevi için Hfq RNA şaperonunu gerektirir. Salmonella Typhimurium’da MicC, ompD mRNA’yı kodlama dizisi içinde bir ≤12-bp RNA dubleks aracılığıyla susturur (kodonlar 23-26) ve daha sonra endonükleolitik mRNA7’nin dengesini bozar. Bu düzenleme süreci şaperon proteini Hfq10 tarafından desteklenir. OmpC, bağırsakta olduğu gibi besin ve toksin konsantrasyonlarının yüksek olduğu ortamlarda önemli olduğu düşünülen bol miktarda bir dış zar proteinidir6. OmpD porin, Salmonella Typhimurium’daki en bol dış zar proteinidir ve toplam hücre proteini11’in yaklaşık% 1’ini temsil eder. OmpD, insan makrofajlarına ve bağırsak epitel hücrelerine yapışmada rol oynar12. MicC ayrıca hem OmpC hem de OmpD porinlerinin ifadesini bastırır. MicC’nin virülansı düzenleyebileceği düşünülmektedir. MicC tarafından düzenlenen yeni hedef genleri keşfetmek ve micC’nin virülans düzenleme fonksiyonunu incelemek için, micC genini Salmonella Enteritidis (SE) suşu 50336’da klonladık ve daha sonra mutant 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / p micC’yi inşa ettik. Yeni hedef genler qRT-PCR ile tarandı. 50336ΔmicC’nin virülansı fareler ve tavuk enfeksiyonları tarafından tespit edildi.

Protocol

Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi’nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’na uygun olarak gerçekleştirildi. Yangzhou Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, hayvanlar üzerinde uygulanan tüm deney ve prosedürleri onayladı (SYXK2016-0020). 1. Bakteriyel suşlar, plazmidler ve kültür koşulları Tablo 1’de listelenen bakteri ve plazmidleri kullanın. LB suyunda veya LB agar plakalarında 37 °C’de, uygun…

Representative Results

Mutant 50336Δ micC ve tamamlanmış gerinim 50336Δ micC /p micC’nin yapımı MicC gen klonu sonucu, bu genin S’ninkiyle 0 özdeşleştiğini gösteren 109 bp’den oluştuğunu gösterdi. Typhimurium. Sekans verilerine dayanarak, silme mutantı 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / pmicC başarıyla inşa edildi. Ay…

Discussion

S. Enteritidis, genç tavukları enfekte edebilen ve enteritten sistemik enfeksiyona ve ölüme kadar semptomlar üreten önemli bir fakültatif hücre içi patojendir17,18. Ek olarak, S. Enteritidis yetişkin tavuklarda gizli enfeksiyonlara neden olur ve kronik taşıyıcılar kümes hayvanı ürünlerini kirleterek insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden olur19. S. Enteritidis’in patojenik mekanizması daha fazl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 31972651 ve 31101826), Jiangsu Yüksek Öğretim Bilim Vakfı (No.14KJB230002), Veteriner Biyoteknoloji Devlet Anahtar Laboratuvarı (No.SKLVBF201509), Yangzhou Doğa Bilimleri Vakfı Hibesi (No.YZ2014019), Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından finanse edilen bir proje tarafından desteklenmiştir.

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Tags

Homologous RecombinationGene InactivationVirulence GenesAttenuated MutantSalmonella EnteritidisChloramphenicol CassetteMicC Gene

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image