암호화되지 않은 작은 RNA MicC는 살모넬라 엔테리티디스의 외막 단백질에서 독성에 기여합니다
Summary
λ-적색 매개 재조합 시스템을 사용하여 작은 비암호화 RNA micC의 결실 돌연변이를 생성했습니다.
Abstract
비코딩 소형 RNA(sRNA)는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 새로운 인자입니다. 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 알려진 일종의 sRNA MicC는 외막 단백질의 발현을 억제할 수 있습니다. 살모넬라 엔테리티디스에서 micC의 조절 기능을 추가로 조사하기 위해, 우리는 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336에서 micC 유전자를 클로닝한 다음, λ 적색 기반 재조합 시스템에 의해 돌연변이 50336Δ micC를 구성하고 micC를 발현하는 재조합 플라스미드 pBR322를 운반하는 보완된 돌연변이 50336Δ micC/p micC를 구성했습니다. qRT-PCR 결과는 50336Δ micC에서 ompD의 전사가 야생형 균주보다 1.3배 더 높은 반면, 50336ΔmicC에서 ompA 및 ompC의 전사 는 야생형 균주보다 2.2배 및 3배 더 높았다. 이들은 micC가 ompA 및 ompC의 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 다음 연구에서, 50336ΔmicC의 병원성은 6주령의 Balb/c 마우스와 1일령의 닭 모두를 감염시켜 검출되었다. 그 결과, 6주령 Balb/c 마우스에 대한 야생형 균주 50336의LD50, 돌연변이체 50336ΔmicC 및 50336Δ micC/pmicC가 각각 12.59 CFU, 5.01 CFU 및 19.95 CFU인 것으로 나타났다. 1 일 된 닭에 대한 균주의LD50은 각각 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU 및 2.54 x 108 CFU였다. micC의 결실이 S의 독성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. Enteritidis는 외막 단백질의 발현을 조절하여 생쥐와 닭에서 발생합니다.
Introduction
비암호화 소형 RNA(sRNA)는 길이가 40-400 뉴클레오티드로, 일반적으로 단백질을 암호화하지 않지만 박테리아 염색체 1,2,3에서 독립적으로 전사될 수 있습니다. 대부분의 sRNA는 유전자 코딩 영역 사이의 유전자 간 영역(IGR)에 암호화되어 염기쌍 작용을 통해 표적 mRNA와 상호 작용하고 전사 후 수준에서 표적 유전자 발현을 조절합니다 4,5. 물질 대사, 외막 단백질 합성, 정족수 감지 및 독성 유전자 발현에서 중요한 조절 역할을 한다5.
MicC는 대장균 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움에 존재하는 109-뉴클레오티드 소RNA 전사체로, OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 및 Omp36 6,7,8,9와 같은 다중 외막 단백질 발현을 조절할 수 있습니다. MicC는 시험관 내에서 ompC mRNA 리더에 대한 리보솜 결합을 억제하여 OmpC의 발현을 조절하며 대장균6에서 기능을 위해 Hfq RNA 샤페론이 필요합니다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에서 MicC는 코딩 서열(코돈 23-26) 내의 ≤12-bp RNA 이중체를 통해 ompD mRNA를 침묵시킨 다음 내핵분해 mRNA7을 불안정화시킵니다. 이 조절 과정은 샤페론 단백질 Hfq10에 의해 지원됩니다. OmpC는 장과 같이 영양소와 독소 농도가 높은 환경에서 중요하다고 생각되는 풍부한 외막 단백질입니다6. OmpD 포린은 살모넬라 티피무리움에서 가장 풍부한 외막 단백질이며 전체 세포 단백질11의 약 1%를 차지합니다. OmpD는 인간 대식세포와 장 상피세포에 대한 순응에 관여한다12. MicC는 또한 OmpC 및 OmpD 포린 모두의 발현을 억제합니다. MicC는 독성을 조절할 수 있다고 생각됩니다. MicC에 의해 조절되는 새로운 표적 유전자를 탐색하고 micC의 독성 조절 기능을 연구하기 위해 살모넬라 엔테리티디스(SE) 균주 50336에서 micC 유전자를 복제한 다음 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p micC를 구성했습니다. 새로운 표적 유전자를 qRT-PCR로 스크리닝하였다. 50336ΔmicC의 독성은 생쥐 및 닭 감염에 의해 검출되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
에스. Enteritidis는 어린 닭을 감염시킬 수 있는 중요한 통성 세포 내 병원체이며 장염에서 전신 감염 및 사망에 이르기까지 증상을 유발합니다17,18. 또한, S. Enteritidis는 성충에게 잠복 감염을 일으키고 만성 보균자는 가금류 제품을 오염시켜 인간에게 식중독 감염을 일으킨다19. S. Enteritidis의 병원성 메커니즘은 더 자세히 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 과학 재단 (Nos. 31972651 및 31101826), 장쑤 고등 교육 과학 재단 (No.14KJB230002), 수의학 생명 공학 국가 핵심 연구소 (No.SKLVBF201509), 양저우 자연 과학 재단 보조금 (No.YZ2014019), 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)이 자금을 지원하는 프로젝트.
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
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