Summary

Een niet-coderende kleine RNA MicC draagt bij aan virulentie in buitenmembraaneiwitten in Salmonella enteritidis

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

Een λ-Rood-gemedieerd recombinatiesysteem werd gebruikt om een deletiemutant te maken van een kleine niet-coderende RNA-micC.

Abstract

Een niet-coderend klein RNA (sRNA) is een nieuwe factor om genexpressie op post-transcriptioneel niveau te reguleren. Een soort sRNA MicC, bekend in Escherichia coli en Salmonella Typhimurium, zou de expressie van buitenmembraaneiwitten kunnen onderdrukken. Om de regulatiefunctie van micC in Salmonella Enteritidis verder te onderzoeken, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis-stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336Δ micC door het op λ Red gebaseerde recombinatiesysteem en de aangevulde mutant 50336Δ micC / p micC met recombinant plasmide pBR322 die micC tot expressie brengt. qRT-PCR-resultaten toonden aan dat transcriptie van ompD in 50336Δ micC 1,3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam, terwijl de transcriptie van ompA en ompC in 50336Δ micC 2,2-voudig en 3-voudig hoger was dan die in de wildtype stam. Deze gaven aan dat micC de expressie van ompA en ompC onderdrukt. In de volgende studie werd de pathogeniciteit van 50336ΔmicC gedetecteerd door zowel 6 weken oude Balb / c-muizen als 1-dag-oude kippen te infecteren. Het resultaat toonde aan dat de LD 50 van de wilde stam 50336, de mutanten 50336Δ micC en 50336ΔmicC/pmicC voor 6 weken oude Balb/c muizen respectievelijk 12,59 CFU, 5,01 CFU en 19,95 CFU waren. De LD 50 van de stammen voor 1-dag-oude kippen waren respectievelijk 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU en2,54 x 10 8 CFU. Het gaf aan dat deletie van micC de virulentie van S verhoogde. Enteritidis bij muizen en kippen door de expressie van buitenmembraaneiwitten te reguleren.

Introduction

Niet-coderende kleine RNA’s (sRNA’s) zijn 40-400 nucleotiden lang, die over het algemeen geen eiwitten coderen, maar onafhankelijk kunnen worden getranscribeerd in bacteriële chromosomen 1,2,3. De meeste sRNA’s zijn gecodeerd in de intergene regio’s (IGR’s) tussen gencoderende regio’s en interageren met doel-mRNA’s door middel van base-pairing acties, en reguleren de expressie van doelgenen op het post-transcriptionele niveau 4,5. Ze spelen een belangrijke regulerende rol in het stofmetabolisme, de synthese van buitenmembraaneiwitten, quorumdetectie en virulentiegenexpressie5.

MicC is een 109-nucleotide klein RNA-transcript aanwezig in Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium, dat meerdere buitenmembraaneiwitexpressie zoals OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 en Omp36 6,7,8,9 zou kunnen reguleren. MicC reguleert de expressie van OmpC door ribosoombinding aan de ompC mRNA-leider in vitro te remmen en het vereist de Hfq RNA-chaperonne voor zijn functie in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium legt MicC ompD-mRNA het zwijgen op via een ≤12-bp RNA-duplex binnen de coderende sequentie (codons 23-26) en destabiliseert vervolgens endonucleolytisch mRNA7. Dit regulatieproces wordt ondersteund door chaperonne-eiwit Hfq10. De OmpC is een overvloedig buitenmembraaneiwit waarvan werd gedacht dat het belangrijk was in omgevingen waar de concentraties voedingsstoffen en toxines hoog waren, zoals in de darm6. De OmpD porine is het meest voorkomende buitenmembraaneiwit in Salmonella Typhimurium en vertegenwoordigt ongeveer 1% van het totale celeiwit11. OmpD is betrokken bij de hechting aan menselijke macrofagen en darmepitheelcellen12. MicC onderdrukt ook de expressie van zowel OmpC- als OmpD-porines. Er wordt gedacht dat MicC virulentie kan reguleren. Om nieuwe doelgenen gereguleerd door MicC te onderzoeken en de virulentieregulatiefunctie van micC te bestuderen, kloonden we het micC-gen in de Salmonella Enteritidis (SE) stam 50336 en construeerden vervolgens de mutant 50336ΔmicC en de aangevulde mutant 50336ΔmicC / p micC. Nieuwe doelgenen werden gescreend door qRT-PCR. De virulentie van 50336ΔmicC werd gedetecteerd door muizen en kippeninfecties.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Research Council. De dierverzorgings- en gebruikscommissie van de Yangzhou University keurde alle experimenten en procedures goed die op de dieren werden toegepast (SYXK2016-0020). 1. Bacteriestammen, plasmiden en kweekomstandigheden Gebruik de bacteriën en plasmiden die in tabel 1 worden vermeld. Kweekbacteriën in LB-bouill…

Representative Results

Constructie van de mutant 50336Δ micC en de gecomplementeerde stam 50336Δ micC /p micCHet resultaat van het micC-genkloon gaf aan dat dit gen was samengesteld uit 109 bp met 100% identiteit met dat van S. Tyfumurie. Op basis van de sequentiegegevens werden de deletiemutant 50336ΔmicC en de gecomplementeerde mutant 50336ΔmicC/pmicC …

Discussion

S. Enteritidis is een belangrijke facultatieve intracellulaire ziekteverwekker die jonge kippen kan infecteren en symptomen veroorzaakt van enteritis tot systemische infectie en overlijden17,18. Bovendien veroorzaakt S. Enteritidis latente infecties bij volwassen kippen en chronische dragers besmetten pluimveeproducten, wat resulteert in door voedsel overgedragen infecties bij mensen19. Het pathogene mechanisme van S<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese National Science Foundation (nrs. 31972651 en 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), een project gefinancierd door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

References

  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Play Video

Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

View Video