Изоляция и анализ плазменных липопротеинов с помощью ультрацентрифугации
Summary
Несколько методов были использованы для анализа липопротеинов плазмы; однако, ультрацентрифугация по-прежнему является одним из самых популярных и надежных методов. Здесь мы описываем метод, касающийся того, как изолировать липопротеины от плазмы с использованием последовательной ультрацентрифугации плотности и как анализировать аполипопротеины как для диагностических, так и для исследовательских целей.
Abstract
Анализ плазменных липопротеинов и аполипопротеинов является неотъемлемой частью диагностики дислипидемии и исследований липидного обмена и атеросклероза. Хотя существует несколько методов анализа липопротеинов плазмы, ультрацентрифугация по-прежнему является одним из самых популярных и надежных методов. Из-за своей нетронутой процедуры разделения, липопротеин фракций, изолированных этим методом могут быть использованы для анализа липопротеинов, аполипопротеинов, протеом, и функциональное исследование липопротеинов с культурными клетками in vitro. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции семи фракций липопротеинов, включая VLDL (d’lt;1.006 g/mL), IDL (d’1.02 g/mL), LDL (d’1.04 и 1.06 g/mL), HDLs (d’1.08, 1.10, и 1.21 g/mL) от плазмы кролика используя последовательно плавая ultracentrifugation. Кроме того, мы представляем читателям, как анализировать аполипопротеины, такие как apoA-I, apoB, и apoE SDS-PAGE и западной blotting и показать репрезентативные результаты липопротеинов и аполипопротеинов профилей с использованием гиперлипидемических моделей кролика. Этот метод может стать стандартным протоколом как для клиницистов, так и для основных ученых для анализа функций липопротеинов.
Introduction
Дислипидемия является основным фактором риска атеросклеротических заболеваний в мире. Высокий уровень липопротеинов низкой плотности (LDL) и низкий уровень липопротеинов высокой плотности (HDL) тесно связаны с высоким риском ишемической болезни сердца (ИБЛ)1,2. В клинических условиях, как LDL-холестерин (LDL-C) и HDL-холестерин (HDL-C) регулярно измеряются с помощью автоматизированного анализатора вклинической лаборатории 3,4. Несмотря на это, важно проанализировать профили липопротеинов в деталях для диагностики дислипидемии и изучения липидного метаболизма и атеросклероза у человека и экспериментальных животных. Сообщалось о нескольких методах анализа плазменных липопротеинов, таких как ультрацентрифугация, хроматография исключения размера (быстрая белковая жидкостная хроматография (FPLC) и высокоэфирная жидкая хроматография (HPLC), электрофорез гелями агарозы и полиакриламида, ядерный магнитный резонанс и селективные химические осадки с использованием полиалентных цилентов и других химических веществ. В 1950-х годах группа Гавел впервые предложила концепцию липопротеинов, определяемых плотностью с использованием ультрацентрифугации, и классифицировала их на чиломикронов (CM), липопротеинов очень низкой плотности (VLDL), липопротеинов средней плотности (IDL), LDL и HDL5, а затем метод был дополнительно изменендругими группами 6,7. До сих пор ультрацентрифугация является самым популярным и надежным методом, в то время как практический протокол по-прежнему недоступен. В этой статье мы попытались описать простой в использовании протокол для изоляции небольшого масштаба плазмы с использованием последовательной плотности плавающей ультрацентрифугации, первоначально описаннойранее 8. Изоляция семи фракций плазменных липопротеинов (длт;1,006 г/мл), IDL (d’1.02 г/мл), LDL (d’1.04 и 1.06 g/mL), HDL (d’1.08, 1.10, и 1.21 g/mL) позволяет исследователям сделать обширный анализ как липопротеинов, так и их композиционных аполипопротеинов9,10,11. Нетронутыми семь последовательных липопротеинов плотности могут быть использованы для анализа функций липопротеинов, а также выступающей на основе клеток в пробирке стратегии. Этот протокол должен быть полезен как для клинической диагностики, так и для фундаментальных исследований. Здесь мы использовали плазму кролика в качестве примера, чтобы продемонстрировать эту технику в то время как плазма от других видов могут быть применены таким же образом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гиперлипидемия является одним из наиболее важных факторов риска развития атеросклеротических заболеваний. Таким образом, анализ плазменных липопротеинов необходим не только для диагностики больных дислипидемией, но и важен для исследования молекулярных механизмов метаболизма липо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана научно-исследовательскими грантами от JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, Национального фонда естественных наук Китая (No 81941001 и 81770457), JSPS-CAS в рамках японо-китайской программы научно-исследовательского сотрудничества.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
