Dénombrement précis des follicules chez les ovaires de souris adultes

Les ovocytes immatures et méiotically-arrêtés stockés dans les follicules primordiaux dans l’ovaire sont l’unité de stockage pour la lignée germinale femelle et comprennent la réserve ovarienne à vie d’un individu. Le nombre de follicules primordiaux diminue naturellement avec l’âge^{de 1}, ou bien, peut être prématurément épuisé à la suite d’une exposition à des produits chimiques exogènes, y compris certains produits pharmaceutiques et toxiques environnementaux dans l’air, les aliments et l’eau². Étant donné que le nombre de follicules primordiaux est fini, la quantité et la qualité des follicules présents dans l’ovaire déterminent en grande partie la fertilité féminine et la santé de la progéniture. Ainsi, la quantification précise du nombre primordial de follicule chez les femmes est essentielle pour évaluer les impacts hors cible des insultes exogènes sur la réserve ovarienne.

Chez les femmes, l’analyse de l’ovaire entier n’est généralement pas possible, ainsi des mesures de substitution non invasives de la réserve ovarienne doivent être utilisées dans un cadre clinique. L’hormone anti-Mϋllerienne (AMH) est le biomarqueur de substitution le plus largement utilisé cliniquement³. Les taux sériques d’AMH sont souvent mesurés chez les femmes d’âge maternel avancé, ou avant et après le traitement du cancer, comme la chimiothérapie. Cependant, l’AMH est produite par la croissance des follicules et non par les follicules primordiaux, et ainsi, les niveaux de sérum n’informent pas sur le nombre absolu de follicules primordiaux.

En l’absence de méthodes pour déterminer avec précision le nombre de follicules primordiaux chez les femmes in situ,le comptage des follicules ovariens chez les petits modèles animaux, tels que les rongeurs, reste un outil de recherche essentiel pour évaluer le degré d’impact des insultes exogènes sur les follicules primordiaux et donc sur la fertilité. Malheureusement, les rapports dans toute la littérature sur les nombres primordiaux de follicules dans les modèles de rongeurs sont très variables^4. L’une des principales raisons en est les différences techniques largement rapportées dans la méthode de comptage utilisée. Principalement, il existe deux techniques différentes décrites dans la littérature pour énumérer les follicules primordiaux chez la souris. Ceux-ci incluent la stéréologie, qui utilise la méthode du dissecteur optique du fractionneur, et le nombre direct de follicules.

La stéréologie est largement considérée comme l’étalon-or car elle utilise un échantillonnage aléatoire uniforme systématique^5,ce qui en fait la méthode la plus précise de quantification du nombre de follicules primordiaux chez les ovaires entiers de souris ou de rats^4,6,7. La stéréologie est impartiale, car elle tient compte de la structure tridimensionnelle de l’objet d’intérêt⁸. À l’aide d’une méthode de dissecteur/fractionneur optique, trois niveaux d’échantillonnage sont appliqués pour quantifier les follicules primordiaux à l’aide de sections tissulaires épaisses (p. ex. 20 μm) dans une fraction connue de l’ovaire total de la souris. Tout d’abord, l’intervalle d’échantillonnage est choisi (par exemple, chaque^3ème section) à un départ aléatoire (fraction d’échantillonnage 1, f₁₎^4. Les sections sont ensuite échantillonnées de manière systématique et uniforme à partir de ce point à travers l’ovaire entier. Ensuite, une base de comptage non biaisée se superpose à la section ovarienne et se déplace progressivement le long d’une grille de comptage définie et randomisée (fraction d’échantillonnage 2,_f2)^8. Enfin, une fraction connue de l’épaisseur de la section est échantillonnée optiquement (par exemple, 10 μm) et les follicules à l’intérieur de cette zone sont comptés (fraction d’échantillonnage 3,_f3)^4. Le nombre de follicules bruts est multiplié par l’inverse de ces fractions d’échantillonnage pour obtenir la valeur finale. Cette méthode nécessite une formation et un équipement d’experts, y compris un microscope avec un étage motorisé piloté par un logiciel téréologique. Les tissus doivent être conservés dans un fixateur de Bouin spécialisé et incorporés dans de la résine de glycolméthacrylate pour permettre de couper des sections de tissus épaisses à l’aide d’un microtome de résine de glycolméthacrylate avec un couteau en verre. Cette méthode est conçue pour tenir compte du rétrécissement et de la déformation des tissus, afin de préserver au mieux la structure morphologique tridimensionnelle de l’ovaire et des follicules^9.

Le comptage direct des follicules est la méthode la plus fréquemment utilisée pour compter les follicules¹⁰. Des fixateurs plus courants (c.-à-d. le forcine) peuvent être utilisés, suivis de l’encastrement de cire de paraffine et du sectionnement exhaustif en série à l’aide d’un microtome standard à une épaisseur comprise entre 4 et 6 μm. Les follicules sont systématiquement comptés dans toute la section tissulaire à un intervalle défini, puis multipliés par l’inverse de l’intervalle d’échantillonnage pour obtenir l’estimation du follicule total. Cette méthode est rapide, facile, peut être réalisée à l’aide de tissus archivés et préparée à l’aide de techniques histologiques standard. Il ne nécessite qu’un microscope optique avec des capacités d’imagerie standard. Cependant, en dépit de ces avantages, le comptage direct de follicule manque de la précision et des paramètres stricts de comptage de la stéréologie, ce qui le rend plus enclin au biais d’investigateur. En outre, les tissus peuvent subir un rétrécissement et une déformation pendant le traitement, perturbant l’intégrité et la morphologie de l’ovaire et rendant ainsi la classification et la quantification des follicules difficiles.

Le but de cet article est de décrire deux méthodes couramment utilisées pour évaluer quantitativement le nombre primordial de follicule dans les ovaires de souris : stéréologie et comptage direct de follicule. Nous fournirons des protocoles détaillés pour ces deux méthodes et mettrons en évidence certaines de leurs forces et faiblesses, afin d’améliorer la reproductibilité dans notre domaine et de permettre aux chercheurs de prendre une décision éclairée quant à la méthode de comptage la plus appropriée pour leurs études.