Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

Evelien Van Hoeymissen; Koenraad Philippaert; Rudi Vennekens; Joris Vriens; Katharina Held

doi:10.3791/61753

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

神经科学

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

Published: September 22, 2020

doi:

10.3791/61753

Evelien Van Hoeymissen^1,2, Koenraad Philippaert², Rudi Vennekens², Joris Vriens*¹, Katharina Held*^1,2

¹Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration,KU Leuven, ²Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine,KU Leuven

Summary

Cet article vise à décrire un protocole systématique pour obtenir des tranches horizontales de cerveau hippocampal chez la souris. L’objectif de cette méthodologie est de préserver l’intégrité des voies de fibre hippocampal, telles que le chemin perforant et le tractus de fibre moussée pour évaluer les processus neurologiques liés au gyrus dentate.

Abstract

L’hippocampe est une structure très organisée dans le cerveau qui fait partie du système limbique et est impliqué dans la formation et la consolidation de la mémoire ainsi que la manifestation de troubles cérébraux graves, y compris la maladie d’Alzheimer et l’épilepsie. L’hippocampe reçoit un haut degré d’intra- et d’interconnectivité, assurant une bonne communication avec les structures cérébrales internes et externes. Cette connectivité se fait par différents flux d’information sous forme de voies fibre. Les tranches de cerveau sont une méthodologie fréquemment utilisée lors de l’exploration des fonctions neurophysiologiques de l’hippocampe. Des tranches hippocampal de cerveau peuvent être employées pour plusieurs applications différentes, y compris des enregistrements électrophysiologiques, des mesures microscopiques légères aussi bien que plusieurs techniques biologiques et histochimiques moléculaires. Par conséquent, les tranches de cerveau représentent un système modèle idéal pour évaluer les fonctions protéiques, pour étudier les processus pathophysiologiques impliqués dans les troubles neurologiques ainsi qu’à des fins de découverte de médicaments.

Il existe plusieurs façons différentes de préparer les tranches. Les préparations de tranches cérébrales avec un vibratome permettent une meilleure préservation de la structure tissulaire et garantissent un approvisionnement suffisant en oxygène lors du tranchage, qui présentent des avantages par rapport à l’utilisation traditionnelle d’un hachoir à tissus. En outre, différents plans de coupe peuvent être appliqués pour les préparations vibratomes de tranche de cerveau. Ici, un protocole détaillé pour une préparation réussie des tranches hippocampales horizontales vibratome-coupées des cerveaux de souris est fourni. Contrairement à d’autres préparations de tranches, le tranchage horizontal permet de maintenir les fibres du chemin d’entrée hippocampal (chemin perforant) dans un état entièrement intact dans une tranche, ce qui facilite l’étude des interactions entorhinal-hippocampal. Ici, nous fournissons un protocole complet pour la dissection, l’extraction, et le tranchage horizontal aigu du cerveau murin, et discutons des défis et des pièges potentiels de cette technique. Enfin, nous allons montrer quelques exemples pour l’utilisation de tranches de cerveau dans d’autres applications.

Introduction

L’exploration étendue de l’hippocampe a commencé quand Scoville et Milner ont rapporté l’incapacité d’un patient (H.M.) de former la nouvelle mémoire déclarative après déplacement chirurgical de l’hippocampe et des structures voisines de lobe temporel comme traitement pour l’épilepsie grave^1. À partir de ce moment, l’hippocampe a été étudié en profondeur à partir des propriétés neuronales générales et des fonctions jusqu’au développement de troubles cérébraux graves, tels que l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer²^,³^,⁴^,⁵. L’hippocampe fait partie du système limbique, composé d’un groupe de structures cérébrales connexes impliquées dans la formation de l’émotion et de^{la mémoire 6}^,⁷. Un réseau dense de plusieurs voies de fibre accomplit une connectivité hippocampal serrée aux structures internes et externes de cerveau. Ces voies incluent le chemin perforant médial et latéral (cortex entorhinal pour bosseter le gyrus, CA3 – CA1 et subiculum)^8,le chemin de fibre moussue (gyrus dentate au CA3)⁹ et la voie collatérale/associationnelle de Schaffer (CA3 à CA1)¹⁰ (figure 1). L’hippocampe présente l’une des zones cérébrales les plus largement explorées jusqu’à présent en raison de son organisation laminaire fortement conservée de la formation de couches neuronales, et de la possibilité d’obtenir des cultures neuronales vitales et des tranches de cerveau avec une relative facilité⁵.

Figure 1 : Dessin animé illustrant les différentes régions hippocampiques et les voies principales de fibre. Les différentes régions hippocampales sont indiquées par des lignes de couleur solide : cortex entorhinal (EC; noir), gyrus dentate (DG; orange), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (jaune), et 1 (magenta), et le subiculum (vert). Les voies de fibre sont montrées avec une ligne pointillée colorée : le chemin perforant médial (MPP, rouge) et latéral (LPP, bleu) (du cortex entorhinal au gyrus dentate, CA3, CA1 et subiculum), la voie de fibre moussée (MF, violet) (du gyrus bosselé au CA3) et la garantie Schaffer (SC, brun) (ipsilateral de CA3 à CA1)/voies commissaires associationnelles (AC, vert clair) (contralatéral de CA3 à CA1). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les protocoles de tranche de cerveau ont souvent comme conséquence la perte des connexions des secteurs plus éloignés de cerveau à la zone^{d’intérêt 5.} En outre, les capillaires ne sont plus^{fonctionnels 5} et la circulation sanguine est privée¹¹. En dépit de ces limitations, les tranches de cerveau sont toujours principalement employées pour l’étude des fonctions neurophysiologiques de l’hippocampe dues à un certain nombre d’avantages. Tout d’abord, l’extraction de l’hippocampe est^{rapide 12} et ne nécessite pas beaucoup de matériaux. Les seuls instruments essentiels comprennent un kit de dissection, un bain d’eau de laboratoire, l’accès au carbogen et un microtome vibrant (vibratome)¹³. D’autres atouts de la technique de tranche de cerveau sont le contournement de la barrière céphalo-cérébrale (BBB) et le lavage des molécules endogènement libérées avant le début de^{l’expérience 5}, qui permet d’étudier l’effet des drogues avec le contrôle relativement précis de dosage^14. En outre, les tranches de cerveau préservent la cyto-architecture et les circuits synaptiques dans l’hippocampe¹⁵^,¹⁶, où la neuroanatomie et l’environnement local avec la connectivité neuronale et les interactions neuronales-glia complexes sont^{préservés 4}^,¹¹^,¹⁷. En outre, les connexions hippocampiques de fibre sont principalement unidirectionnelles et les neurones hippocampal ont une plasticité synaptique élevée, qui simplifie énormément la collection et l’interprétation des enregistrements électrophysiologiques de haute qualité afin de comprendre des processus neurologiques¹⁸^,^19. Fait important, les tranches de cerveau présentent un atout précieux applicable dans un large éventail de techniques scientifiques différentes, allant des techniques biologiques moléculaires aux enregistrements d’imagerie jusqu’aux mesures électrophysiologiques^12,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶.

Comme indiqué ci-dessus, les tranches de cerveau hippocampal présentent un outil expérimental puissant pour étudier les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de la connectivité synaptique. Cela offre la possibilité d’évaluer les effets des produits chimiques ou des mutations sur l’excitabilité neuronale et la plasticité¹⁶.

Les préparations aiguës en tranches cérébrales présentent une technique relativement sensible et la qualité optimale des tranches dépend fortement de conditions expérimentales idéales, y compris l’âge de l’animal, la méthode d’euthanasie, la vitesse de dissection et de tranchage, les solutions et paramètres de tranchage (p. ex., la vitesse de tranchage) ainsi que les conditions de récupération^{des tranches 4}. Par conséquent, un protocole bien conçu est d’une importance absolue et assure la reproductibilité entre les différentes unités de recherche¹³.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour les préparations horizontales aiguës de tranche d’hippocampe, dans le but de préserver l’intégrité du chemin latéral et médial hippocampal de perforant et de la voie mossy de fibre, permettant l’investigation des processus liés au gyrus de^{bosselé 9.} Nous décrirons en détail les étapes clés pour disséquer, extraire et trancher horizontalement le cerveau murin, suivis des résultats représentatifs des enregistrements calcium-microfluorimétriques et des enregistrements potentiels postsynaptiques excitatifs sur le terrain (FEPSP) dans des conditions de base et pendant les protocoles d’induction du LTP dans des tranches cérébrales de souris sauvages de type C57BL/6J.

Protocol

Toutes les expériences animales de cette étude ont été approuvées par le comité d’examen éthique de la KU Leuven (Belgique) (P021/2012). 1. Préparation d’une solution de tranche de saccharose élevée et d’un liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) Avant la journée expérimentale Préparer 1 L de pré-solution de tranche de 10x avec de l’eau de type 1 de laboratoire contenant (en mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12,5 KH2PO4 (Tableau 1). Afin d’éviter les précipitations de phosphate de calcium, mélanger lentement les produits chimiques dans un bécher pré-rempli de 800 mL H2O tout en remuant constamment avec un agitateur magnétique. Conserver la solution à 4 °C ou à température ambiante (RT). Le jour expérimental Préparer 1 L de 1x ACSF avec de l’eau de laboratoire de type 1 contenant (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucose (Tableau 2). Utilisez un osmomètre de pression de vapeur pour valider l’osmolarité entre 305-315 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).REMARQUE : Afin d’éviter les précipitations de phosphate de calcium, mélangez lentement tous les produits chimiques solides dans un bécher prére rempli de 800 mL de H2O tout en remuant constamment avec un agitateur magnétique. Ajoutez MgSO4 et CaCl2 à la toute fin, dégoulinant lentement de la quantité nécessaire à partir de solutions de stock de 1 M. Bulle continue 1x ACSF solution chez RT avec carbogen pour régler le pH entre 7,3-7,4.REMARQUE : Si le pH est légèrement trop élevé ou trop bas, de petits ajustements de la résistance à la carbogénation seraient suffisants. Si le pH est supérieur à 7,45 avec carbogenation, ajustez-le en ajoutant quelques gouttes de 1 M NaH2PO4 solution. Préparer 250 mL (par cerveau) de solution de tranche de saccharose 1x haute dans un bécher contenant 25 mL de pré-solution de tranche de 10x et (en mM): 252 Saccharose, 26 NaHCO3, et 10 glucose (tableau 3). Vérifiez que l’osmolarité se situe entre 320 et 325 mOsm (pH ~ 7,55-7,6). Bulle de la solution de tranche de saccharose élevé pendant 10-15 min avec carbogen pour contrôler le pH entre 7,3-7,4.REMARQUE : Si le pH est supérieur à 7,45 avec carbogenation, ajustez-le en ajoutant quelques gouttes de solution KH2PO4 de 1 M KH. Conserver la solution de tranche de saccharose haute pendant 20-30 min dans l’ultra congélateur (-80 °C) jusqu’à ce qu’elle soit partiellement congelée. 2. Préparation de l’espace de travail pour la dissection du cerveau Pendant le refroidissement de la solution de tranche de saccharose élevée, préparer ce qui suit. Réchauffer le bain d’eau à 32 °C. Remplissez la chambre de récupération (Figure 2A) avec la solution ACSF carbogenated et placez la chambre dans le bain d’eau. Appliquez continuellement le carbogen à la bouteille principale d’ACSF et à l’ACSF dans la chambre de récupération. Inaugurez l’animal à la salle expérimentale.REMARQUE : L’âge, le sexe et la souche de l’animal doivent être déterminés par l’expérimentateur individuel et dépendent de la question spécifique de l’étude. Cependant, les paramètres de l’animal doivent rester constants dans une étude afin de garantir la comparabilité entre les différents jours expérimentaux. Ce protocole a été conçu pour l’utilisation de souris mâles C57BL/6J à l’âge de 2-6 semaines. Si des animaux plus âgés seront utilisés, les solutions de tranche et de récupération devront peut-être êtreadaptées en conséquence 4,27 (p. ex., solutions NMDG+basées23,28) afin de préserver la santé cérébrale des tranches aiguës. Préparer la chambre d’anesthésie. Déposer le papier de soie, la pipette pasteur en plastique à grande ouverture (coupée ouverte), plat de culture de 90 mm rempli de glace, un carré de papier filtre sur le dessus du plat de culture réfrigéré, des ciseaux solides pour la décapitation, des ciseaux de dissection, des forceps incurvés, une spatule, un plat de culture de 35 mm, une brosse fine, une lame, une plaque de spécimen (est livré avec vibratome), une super colle, une pointe de pipette, quatre sangles de papier filtre (~ 2 cm x 0,5 cm) (figure 2A). Configurer le vibratome : Tout d’abord, programmer le vibratome pour les réglages corrects (vitesse de déplacement de la lame : 0,08 mm/s, amplitude de coupe : 1,4 mm, fréquence de coupe : 85 Hz) et fixer la ligne de carbogen dans la chambre de tranche. Ensuite, placez la chambre de tranche dans le support, remplissez le support entourant la chambre de tranche avec de la glace et attachez tout au vibratome. Enfin, placez la lame de rasoir dans le porte-lames vibratoire( Figure 2B). Après le gel de la solution à saccharose élevé effectuer les étapes suivantes. Après 20-30 min, sortez la solution de tranche de saccharose haute de l’ultragel de -80 °C et gardez le bécher sur la glace. Placez la solution à haut saccharose à côté du vibratome sur votre banc, écraser et mélanger la solution partiellement congelée avec une spatule pour obtenir une belle neige fondante et commencer à bouillonner avec du carbogen. Prenez une solution de tranche de saccharose haute avec la pipette pasteur en plastique pour tremper le papier filtre carré sur le dessus du plat de culture réfrigéré de 90 mm. Remplissez le plat de culture de 35 mm (ou tout petit récipient équivalent qui convient pour stocker tout le cerveau) jusqu’à 75% avec la solution de tranche de saccharose élevée (suffisante pour couvrir tout le cerveau) et refroidir le plat de culture sur la glace gardée à côté du bécher avec le reste de la solution. Carbogenate la solution dans le plat de culture 35 mm. 3. Dissection et positionnement du cerveau murin Anesthésier l’animal avec 5% d’isoflurane. Déterminez la profondeur appropriée de l’anesthésie en pinçant la patte. Aucun réflexe de retrait de patte ne devrait se produire. Transférez l’animal sur du papier de soie et décapitez-le avec de solides ciseaux ou une petite guillotine animale. Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir le cuir chevelu. Coupez la calvaria le long de la suture sagittale et retirez-la à l’aide de forceps incurvés jusqu’à ce que tout le cerveau, y compris les ampoules olfactives, soit visible.REMARQUE : Veillez à ne pas endommager le cerveau avec les bords tranchants de la calvaria ou des forceps. Utilisez une spatule pour ramasser soigneusement le cerveau (les ampoules olfactives doivent rester attachées). Transférer le cerveau dans le plat de culture réfrigéré de 35 mm et enlever toutes les particules de cheveux ou de sang du tissu en lavant doucement le cerveau avec une pipette Pasteur remplie d’ACSF (le sang a des effets cytotoxiques sur les tissuscérébraux 29). Transférer le cerveau à l’aide de la spatule sur le papier filtre trempé sur le dessus du plat de culture réfrigéré de 90 mm (Figure 2A). Utilisez une lame pour couper le cerveau en deux, séparant les deux hémisphères, et placez les deux hémisphères sur le côté médial fraîchement coupé. Utilisez une lame pour enlever la partie dorsale (5%-10%) du cerveau de chaque hémisphère avec une coupe parallèle au sommet dorsale (Figure 2C)30 et placer les deux hémisphères sur le côté fraîchement coupé avec la partie ventrale du cerveau face vers le haut. Placez une goutte de colle super sur la plaque de spécimen et étalez-la correctement avec une pointe de pipette pour accueillir les deux hémisphères. Utilisez une sangle de papier filtre pour ramasser un hémisphère avec des forces capillaires en touchant le côté ventral avec la sangle de papier filtre, n’endommageant ainsi pas le tissu. Utilisez une autre sangle de papier filtre pour sécher soigneusement le côté dorsale du cerveau avant de positionner l’hémisphère avec le côté dorsale vers le bas sur le dessus de la colle sur la plaque de l’échantillon. Répétez la même procédure avec le deuxième hémisphère.REMARQUE : Les hémisphères doivent être placés en alignement horizontal de façon miroir sur la plaque vibratoire, les côtés rostrals pointant vers l’extérieur et les côtés caudales se faisant face (mais ne se touchant pas) au milieu. Les côtés médiaux des deux hémisphères doivent pointer vers la lame vibratoire et les côtés latéraux vers l’expérimentateur (Figure 2D). Placez la plaque d’échantillon dans la chambre de tranchage et recouvrez-la rapidement, mais soigneusement, de neige fondante glacée à tranche de saccharose élevée. Dès que la solution touche la colle, elle solidifie et colle correctement les hémisphères à la plaque de spécimen. Assurez-vous que les hémisphères sont correctement recouverts d’une solution de tranche de saccharose élevée et confirmez que la solution est bouillonne de carbogen.REMARQUE : Toute la procédure de dissection doit être effectuée aussi vite que possible. S’il vous plaît assurez-vous que le cerveau ne reste pas sans l’approvisionnement en oxygène pendant une très longue période. Il ne devrait prendre qu’environ 1-1,5 min de la décapitation à la submersion du cerveau dans la solution de tranche de saccharose élevée neige fondante. C’est l’exigence la plus critique pour les préparations aiguës de tranche de cerveau afin de justifier la qualité élevée de la tranche. 4. Tranchage horizontal du cerveau Placez la lame vibratoire devant le côté médial des hémisphères et abaissez-la à la même hauteur que les côtés ventraux des hémisphères qui sont maintenant orientés vers le haut. Abaissez la lame à l’aide du contrôle vibratome à 600 μm plus loin dans la direction dorsale et commencez à trancher. La lame doit frapper le tissu (sinon, inverser la lame et l’abaisser un peu plus). Trancher jusqu’à ce que les deux premières tranches soient complètement séparées des deux hémisphères. Inverser la lame et abaisser encore 300 μm et trancher à nouveau. Lorsque l’hippocampe devient visible (utilisez l’atlascérébral de la souris 31 pour obtenir de l’aide, si nécessaire) ( Figure2E) recueillir les tranches avec la pipette pasteur en plastique élargie. Recueillir les tranches jusqu’à ce que le putamen caudate devienne visible à côté de l’hippocampe. En règle générale, entre 8 et 12 tranches de 300 μm (4-6 par hémisphère) peuvent être collectées pour le cerveau de la souris. Utilisez la pipette Pasteur en plastique pour recueillir les tranches et les transférer dans la chambre de récupération dans le bain d’eau (figure 2F) (recueillir des tranches après chaque tour de tranchage pour les empêcher de flotter dans la chambre de tranche).REMARQUE : Travaillez aussi vite que possible et assurez-vous que la solution de tranche de saccharose élevée est glacée et carbogenated pendant toute la procédure. Si nécessaire, remplissez la glace entourant la chambre à tranches. 5. Récupération des tranches de cerveau pour les enregistrements électrophysiologiques Laissez les tranches dans la chambre de récupération remplie d’ACSF dans le bain d’eau de 32 °C pendant 1 h.REMARQUE : Les chambres de récupération sont également disponibles dans le commerce. Sortez la chambre de récupération du bain d’eau. Placer les tranches à RT pendant au moins 30 minutes de récupération avant de commencer toute autre application. 6. enregistrements fEPSP dans le chemin perforant médial (MPP) de l’hippocampe Tirez les pipettes d’enregistrement des capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un pulltte à pipette horizontale pour recevoir des pipettes de la taille d’environ 2 MΩ lorsqu’elles sont remplies de solution ACSF et immergées dans la chambre d’enregistrement remplie d’ACSF. Remplissez la solution de bain ACSF et la solution ACSF contenant les produits chimiques appropriés (p. ex., bicuculline) dans un système de perfusion multi-barils contrôlé par gravité qui est relié à la chambre d’enregistrement. Carbogenate en permanence toutes les solutions. Allumez une pompe périssaliste ou sous vide qui est reliée à un tube d’aspiration qui se termine en face de la ligne de perfusion dans la chambre d’enregistrement. Ouvrez le canon rempli d’ACSF et commencez à établir un débit continu (1-2 gouttes par seconde). Vérifiez que l’électrode de référence est immergée dans la solution ACSF. Allumez l’ordinateur d’installation, l’amplificateur, le micromanipulateur, le stimulateur, la lumière du microscope(s), la caméra et le moniteur (le cas échéant). Ouvrez le logiciel approprié pour les enregistrements électrophysiologiques (plusieurs fournisseurs de matériel et de logiciels différents pour l’équipement électrophysiologique existent). Transférez un hémisphère de tranche de cerveau de la chambre de rétablissement à la chambre d’enregistrement de la configuration de tranche et placez-le dans l’orientation correcte avec la couche granule de granule de gyrus dentate et la couche moléculaire dans le champ de vision. Assurez-vous que l’électrode de stimulation peut atteindre le MPP dans la tranche de la direction du cortex entorhinal et que l’électrode d’enregistrement a accès au député de l’autre côté exact de la direction de CA3. Stabilisez la tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’un trombone(figure 3A)ou d’une grille de tranches de cerveau disponibles dans le commerce.REMARQUE : Il peut être utile d’éteindre la perfusion lors du transfert et du positionnement des tranches. Toutefois, cela ne devrait pas prendre trop de temps afin de garantir la qualité de la tranche du cerveau. Abaisser et positionner les électrodes d’enregistrement et de stimulation dans le MPP dans le tiers inférieur de la couche moléculaire près de la couche de cellules granulés (figure 3B), face à face à une distance d’environ 100-150 μm. L’électrode de stimulation doit entrer en contact minimal avec la surface, tandis que l’électrode d’enregistrement doit légèrement s’infiltrer dans la couche supérieure de la tranche. Appliquer un stimulus de faible intensité (30-50 μA pour 0,1 ms) sur la tranche du cerveau afin d’obtenir le signal fEPSP. Adapter la position des électrodes si nécessaire (p. ex., signal fEPSP de forme basse ou atypique). Commencez à enregistrer les courbes input-output : appliquez des intensités de stimulus croissantes sur la tranche du cerveau dans des intervalles de 30 s. Réglez l’intensité de stimulus à 50% de la réponse fEPSP maximale et commencer les enregistrements fEPSP de base en appliquant l’intensité de stimulus de 50% pendant 20-40 min en intervalles de 30 s à la tranche du cerveau. Si la ligne de base semble stable, procéder à d’autres enregistrements (p. ex., protocoles LTP/LTD et/ou applications de médicaments). (Pour l’induction du LTP dans le MPP, ici un protocole composé de quatre fois 1 s 100 impulsions Hz appliquées dans un intervalle de 5 min a été utilisé. Bicuculline a été appliqué 10 min avant et pendant la phase de conditionnement.)REMARQUE : Tous les enregistrements doivent être effectués en mode pince actuel avec un filtrage à faible passage approprié (10 kHz). Extraire les données dans un format de fichier approprié et analyser les paramètres fEPSP, tels que la volée de fibres, l’amplitude fEPSP, et la pente fEPSP. 7. Enregistrements d’imagerie calcique de tranches de cerveau Transférer un hémisphère de tranche de cerveau dans une chambre de 12 puits et le charger pendant 30 min à 1 h avec un colorant de calcium approprié. Carbogenate continuellement la solution de chargement en insérant un tube de carbogenation par un trou self-made (avec une aiguille chaude de 18G) dans le couvercle de la plaque de 12 puits.REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire en cas de préparation de tranches cérébrales d’animaux génétiquement modifiés qui expriment endogènement un journaliste fluorescent tel que GCaMP. Préparez la configuration de l’enregistrement décrite dans les étapes 6.2-6.5.REMARQUE : Aucun amplificateur ou micromanipulateur n’est nécessaire pour les expériences d’imagerie microfluorimétrique. L’utilisation d’un stimulateur dépend de l’expérience. Un logiciel spécifique pour les expériences d’imagerie par fluorescence est essentiel. Réglez le logiciel aux paramètres d’imagerie corrects : cela inclut l’amplificateur de caméra et le réglage de binning, le réglage de la longueur d’onde, le temps d’exposition, et le protocole de synchronisation. Les paramètres peuvent varier en fonction des expériences exactes. (Par exemple, les traces, 1 x 1 binning, 2,4 x gain pré-amplificateur, 300 em gain de caméra, l’exposition de 50 ms à 488 nm répété tous les 500 ms pour la durée de l’expérience a été utilisé.) Après chargement avec le colorant calcique, transférer l’hémisphère de tranche de cerveau du 12-puits à la chambre d’enregistrement et le positionner sur l’étape du microscope. Stabilisez la tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’un trombone(figure 3A)ou d’une grille de tranches de cerveau disponible dans le commerce semblable à celle décrite à l’étape 6.7. Assurez-vous que le domaine d’intérêt est dans le champ microscopique correct et dans la mise au point. Utilisez le logiciel d’imagerie par fluorescence pour sélectionner plusieurs régions d’intérêt (IA) sur votre tranche.REMARQUE: Il peut être utile de sélectionner l’ensemble du champ de vision pour suivre les fluctuations générales de luminosité, en raison de la photobleaching. Commencez l’enregistrement et appliquez les médicaments expérimentaux à l’heure choisie.REMARQUE : Il est conseillé d’appliquer une solution K+ élevée à la fin de chaque expérience pour vérifier le caractère neuronal des cellules et la qualité de la tranche. Extraire les données dans un format de fichier approprié et analyser les changements de signal de fluorescence qui se produisent dans les ROM sur l’ensemble de la mesure. Les IA peuvent également être adaptés lors de l’analyse hors ligne.NOTE : D’autres protocoles qui décrivent des enregistrements de fEPSP et la microfluorimétrie de calcium dans des tranches de cerveau sont disponiblesdans la littérature 24,32,33,34,35.

Representative Results

Vue d’ensemble générale des outils et des étapes critiques nécessaires au protocoleLa figure 2 présente tous les outils et les étapes critiques nécessaires à la préparation des tranches horizontales aiguës du cerveau hippocampal décrites dans ce protocole. En général, un nombre limité d’instruments clés sont nécessaires, y compris quelques outils de dissection et une chambre de récupération des tranches (figure 2A), un bain d’eau de laboratoire et un vibratome (figure 2B). La figure 2C-E visualise les étapes et les orientations importantes du cerveau et des hémisphères pendant le protocole de préparation des tranches. La figure 2F est une illustration d’un résultat attendu de tranches horizontales du cerveau. enregistrements fEPSP dans le chemin perforant médialAprès la période de récupération, les tranches de cerveau peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques de fEPSP. Ici, nous avons utilisé un microscope droit équipé d’un système de perfusion multicanal contrôlé par gravité(figure 3A et figure 3B). Une micropipette en verre (~ 2 MΩ) a été remplie de solution ACSF et fixée au-dessus d’une électrode argentée recouverte de chlorure qui est montée sur un amplificateur opérationnel en circuit avec une électrode de bain chlorée. les fEPSP ont été enregistrés et visualisés à l’aide d’un amplificateur et d’un logiciel d’enregistrement approprié en insérant la micropipette de verre dans le MPP de l’hippocampe dans la couche supérieure de la tranche cérébrale. les fEPSP ont été induits par la stimulation avec une microélectrode de faisceau à 2 contacts, appliquant différentes intensités actuelles au MPP en amont de l’électrode d’enregistrement. Notez que ce protocole n’a pas pour but d’expliquer comment obtenir les enregistrements des députés, mais utilise simplement des enregistrements dans le député comme exemple pour démontrer le succès du protocole de préparation des tranches décrit ici. Si quelqu’un tente d’effectuer des enregistrements de MPP, certains contrôles (p. ex., enregistrements d’impulsions appariés) pourraient être nécessaires pour assurer le site d’enregistrement approprié et distinguer le député provincial du PL8,36,37. La figure 3C illustre un exemple négatif (panneau gauche, tranche de mauvaise qualité) et positif (panneau droit, tranche de haute qualité) d’un enregistrement fEPSP. La trace d’exemple négatif montre une grande amplitude de volée de fibre (FV) qui est encore plus élevée que l’amplitude réelle de fEPSP (≈0.5 mV). En revanche, l’exemple de tranche de haute qualité (panneau droit) montre un petit rapport FV/fEPSP et une amplitude fEPSP élevée (>0.5 mV). La fibre de volée est le signal qui se produit lors de la dépolarisation des fibres neuronales stimulées et précède donc la potentialisation postsynaptique (fEPSP). La relation entre fv et propriétés fEPSP fournit des informations importantes sur la préservation des propriétés axonales et synaptiques. Les tranches de haute qualité avec les fibres nerveuses intactes devraient montrer un rapport élevé d’amplitude de fEPSP à FV. Au contraire, les tranches de mauvaise qualité ayant des propriétés de conduction altérées auront un rapport fEPSP/FV diminué. De même, la viabilité d’une tranche de cerveau peut être analysée en traçant les pentes fEPSP par rapport aux amplitudes de volée de fibre (Figure 3D). De plus, les courbes input-output (pente fEPSP et amplitude FV par rapport à l’intensité du stimulus) sont utilisées de façon standard afin de déterminer la qualité des tranches. Ces courbes sont obtenues en appliquant des stimuli actuels croissants à la tranche du cerveau et en surveillant les réponses suivantes fEPSP. Les tranches de cerveau de mauvaise qualité montrent une courbe d’entrée-sortie réduite due aux propriétés de conduction sous-optimales du tissu cérébral mal préservé(figure 3E,F). En outre, des courbes input-output sont nécessaires pour définir la plage d’intensité de stimulation idéale pour l’étude des processus synaptiques. Idéalement, l’intensité de stimulus devrait être réglée autour de 50% de l’intensité pour des réponses maximales. À cette intensité de stimulus choisie, les réponses fEPSP sont très sensibles à tout changement dans la plasticité synaptique, qui offre la possibilité d’étudier à la fois la potentialisation à long terme (LTP) et la dépression à long terme (LTD). Afin d’étudier la plasticité synaptique, la transmission synaptique de la tranche du cerveau (pente fEPSP) à l’intensité de stimulus choisie de 50% est surveillée pendant une plus longue période de temps (généralement entre 20-40 min) avant la phase de conditionnement. Les tranches de cerveau viables auront des lignes de base stables, tandis que les tranches de cerveau avec une ligne de base instable ne peuvent pas être utilisées pour d’autres protocoles de conditionnement afin d’étudier la plasticité synaptique des circuits cérébraux (figure 3G, panneau supérieur). les enregistrements de base fEPSP peuvent également être utiles afin de surveiller les effets des médicaments sur la transmission synaptique elle-même(figure 3G, panneau inférieur). La moyenne des signaux de base fEPSP enregistrés est généralement utilisée pour normaliser un cours du temps fEPSP et est fixée de façon standard à 100 %. La plasticité synaptique peut être étudiée en appliquant des protocoles de conditionnement spécifiques aux tranches du cerveau. Ces protocoles dépendent du circuit cérébral étudié et du mécanisme d’intérêt (p. ex., LTP ou LTD). Afin d’induire le LTP dans le MPP du gyrus de bosselé, un protocole de conditionnement fort est nécessaire en raison de l’inhibition gabaergique forte qui est présente aux synapses de MPP38. Il est rapporté que l’inhibition GABAergic est encore plus prononcée dans les tranches de cerveau préparées avec des solutions de tranchage à hautsaccharose 39. Ici, nous utilisons un protocole composé de quatre stimulations de 1 s de long 100 impulsions Hz appliquées dans un intervalle de 5 min tout en étant traité avec le GABAA antagoniste des récepteurs Bicuculline (Figure 3H). La co-addition de NMDA et bicuculline pendant la période de conditionnement se traduit par une augmentation du LTP(figure 3H). La mauvaise qualité de la tranche et la transmission synaptique instable (base fEPSP) pourraient entraîner une modification ou l’induction infructueuse du LTP et de l’LTD. Par conséquent, il est d’une grande importance de travailler avec des préparations de tranches de haute qualité et d’utiliser des critères d’exclusion rigoureux (faible amplitude fEPSP par rapport à la fibre de volée (<3), petite pente fEPSP (<0.5 mV/ms) ou amplitude (<0.5 mV) et instable fEPSP de base (changement de plus de 5%) pour les tranches non viables lors de l’étude des processus synaptiques. Mesures microfluorimétriques du calcium dans la couche de cellules granulés du gyrus dentateAprès rétablissement, une tranche de cerveau a été incubée à température ambiante avec 2 μM d’un colorant calcium-sensible pendant 1 h dans ASCF carbogenated, protégé de la lumière. La tranche a été transférée dans une chambred’enregistrement (figure 3A)sur un microscope à fluorescence verticale équipé d’un système de perfusion multicanal contrôlé par gravité. Des images d’émission de fluorescence ont été acquises toutes les 500 millisecondes après illumination à 488 nm(figure 4A,B). Excitation a été fait avec une lampe xénon et un scanner monté diffraction râpant monochromator et l’acquisition d’image a été effectuée avec une caméra CCD contrôlée par ordinateur. Pendant les mesures, la tranche a été traitée avec l’antagoniste de récepteur de NMDA APV, qui a eu comme conséquence une diminution de la concentration intracellulaire de calcium. La stimulation de la tranche avec une solution extracellulaire contenant une forte concentration de potassium (50 mM) a entraîné un afflux massif de calcium extracellulaire en raison de la dépolarisation des neurones et de l’ouverture de canaux irionaux à portail de tension (figure 4C). composé Concentration (mM) Poids moléculaire (g/mol) Montant (g) Kcl 25 74.55 1.86 CaCl2 * 2H2O 20 147.01 2.94 MgSO4 * 7H2O 10 246.48 2.46 KH2PO4 12.5 136.08 1.7 Tableau 1 : Pré-solution de tranche de 10 x (1 L). composé Concentration (mM) Poids moléculaire (g/mol) Montant (g) NaCl (NaCl) 125 58.44 7.3 Kcl 2.5 74.55 0.19 CaCl2 * 2H2O 2 à partir de 1 M CaCl2 solution 2 mL MgSO4 * 7H2O 1 à partir de 1 M MgSO4 solution 1 mL NaH2PO4 * 2H2O 1.25 156.02 0.2 NaHCO3 26 84.01 2.18 Glucose * H2O 25 198.17 4.95 Tableau 2 : 1x ACSF (1 L) (osmolarité entre 305 et 315 mOsm). composé Concentration (mM) Poids moléculaire (g/mol) Montant (g) Présolution de 10 x tranches N/A N/A 25 mL saccharose 252 342.3 21.57 NaHCO3 26 84.01 0.55 Glucose * H2O 10 198.17 0.49 Tableau 3 : 1x solution de tranche de saccharose haute (250 mL) (osmolarité entre 320 et 325 mOsm). Figure 2 : Renseignements détaillés sur la préparation des tranches horizontales du cerveau hippocampal. (A) Image des outils nécessaires à la dissection et au tranchage du cerveau des rongeurs : a) ±2 cm de long et ±0,5 cm de large sangles de papier filtre (p. ex., grade 413); b) lame; c) super colle; d) pointe pipette; e) plaque de spécimen (est livré avec vibratome); f) plat de culture de 35 mm; g) brosse fine; h) spatule; (i) forceps incurvés; j) ciseaux de dissection; k) ciseaux solides (longueur de lame supérieure à 10 cm); l) pipette Pasteur en plastique à ouverture large (entre 0,6 et 0,8 cm de diamètre); m) chambre de récupération (self-made avec bécher de 250 mL, anneau en plastique, maille de nylon, morceau d’une pipette sérologique de 10 mL); n) plat de culture de 90 mm rempli de glace et (o) carré de papier filtre sur le plat de culture réfrigéré. (B) Image d’un vibratome avec (a) support de chambre de tranche remplie de glace ; b) chambre de tranche; c) ligne de carbogen et (d) lame de rasoir de coupe. (C) Dessin animé illustrant l’orientation de la coupe du côté dorsal d’un hémisphère afin de préparer le cerveau pour le tranchage horizontal (voir étape 3.9). (D) Projection isométrique de l’orientation cérébrale sur la plaque de spécimen du vibratome. (E) Dessin animé illustrant une vue supérieure de la position des deux hémisphères sur la plaque du spécimen. (F) Dessin animé montrant la position de l’hippocampe dans une tranche horizontale du cerveau. Les régions de gyrus dentate (DG) et Cornu Ammonis (CA)-Subiculum (SB) de l’hippocampe sont indiquées. (G) Image d’une chambre de récupération avec ACSF carbogenated contenant dix tranches horizontales fraîchement tranchées de cerveau. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Enregistrements électrophysiologiques de tranches de cerveau hippocampal. (A) Image d’une chambre d’enregistrement avec perfusion et aspiration, utilisée sous un microscope droit. Une tranche de cerveau sera placée dans la chambre et immobilisée avec un morceau d’un trombone avant le début des enregistrements. (B) Image lumineuse de champ d’une tranche hippocampal de cerveau sous un microscope droit (objectif de 10x). Les électrodes dentate gyrus (DG) et CA3 sont indiquées ainsi que la stimulation (en bas à gauche) et l’enregistrement (en bas à droite) des électrodes, ciblant le chemin perforant médial lors des enregistrements fEPSP. (C) Gauche : représentation d’une tranche de mauvaise qualité exemple d’enregistrement fEPSP avec une volée de fibre robuste et une petite amplitude. Droite : exemple de tranche de haute qualité d’un enregistrement fEPSP. La ligne grise indique le niveau de base. Les lignes pointillées soulignent l’amplitude de coupure de 0,5 mV. (D) Parcelle de la pente fEPSP par rapport à l’amplitude FV pour la haute qualité (noir; n =10) et les tranches de cerveau de mauvaise qualité (gris; n =4). Données représentées comme moyenne ± SEM. (E) Parcelle input-output (pente fEPSP) pour différentes intensités de stimulation (μA) pour les tranches de haute qualité (noir; n = 10) et les tranches de faible qualité (gris; n = 4)). (F) Même que dans (E) mais pour les amplitudes FV par rapport aux intensités de stimulus. (G) Cours du temps de trois enregistrements fEPSP de base différents (pente de fEPSP en %; normalisé à la pente moyenne fEPSP des 5 premières minutes). Le panneau supérieur représente un exemple positif (noir) et négatif (rouge), où ce dernier a une ligne de base instable en raison de l’omission du carbogen pendant l’enregistrement. Le panneau inférieur montre deux enregistrements de ligne de base stables dans traité (après 20 min de ligne de base stable, les récepteurs AMPA ont été bloqués par l’application de l’antagoniste des récepteurs AMPA DNQX (10 μM)) (bleu) et de l’état non traité (noir). (H) Cours du temps des enregistrements LTP pour différentes conditions de traitement (indiqué dans le panneau inférieur). Couleur noire pour l’application de bicuculline (20 μM) pendant le conditionnement et bleu pour la co-application de Bicuculline (20 μM) et NMDA (10 μM) pendant le conditionnement. Les flèches dans le panneau supérieur indiquent les points de temps où la stimulation à haute fréquence a été appliquée (4 x 1 de 100Hz). Graphique à barres dans le panneau inférieur représente les pentes moyennes fEPSP (%) pendant 50-60 min après l’induction LTP des expériences montrées dans le panneau supérieur (enregistrement représentatif unique pour chaque condition). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Microfluorimétrie calcium des tranches de cerveau hippocampal. (A et B) Image de fluorescence (excité à 488 nm) (A) et carte thermique correspondante (B) d’une tranche horizontale du cerveau hippocampal du cerveau de la souris. Le gyrus dentate (DG), la région CA3, et un exemple d’une région d’intérêt (ROI) sont indiqués dans le panneau A. (C) Cours du temps des réponses de calcium (F488 nm)d’un roi dans le gyrus dentate d’une tranche hippocampal aiguë de cerveau pendant le traitement avec l’antagoniste de récepteur de NMDA APV (50 μM) et solution contenant le potassium extracellulaire élevé (K+) (50 mM). La trace est normalisée à la réponse la plus élevée de calcium pendant la perfusionélevée de K + et est la ligne de base corrigée pour le photobleaching. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Bien que couramment utilisés dans la communauté des neurosciences, les préparations de tranches de cerveau sont également confrontées à plusieurs inconvénients. Par exemple, les connexions d’entrée et de sortie aux zones cérébrales d’intérêt ne sont plus reliées dans une tranche de cerveau. En outre, une fois isolé, le tissu commence à se dégrader lentement au fil du temps et ce processus pourrait modifier les conditions physiologiques de la tranche du cerveau. Ce sujet en particulier est très préoccupant parce que la plupart des enregistrements de tranches de cerveau prennent plusieurs minutes à heures, ce qui se traduit par de longues journées expérimentales avec des enregistrements effectués sur des tissus qui ont été isolés jusqu’à 6-8 h avant le début de l’expérience. En outre, le liquide céphalo-rachidien et la circulation sanguine sont interrompus pendant les préparations de tranches, ce qui peut conduire à l’absence de composés endogènes importants dans une tranche de cerveau. Et le plus évidemment, la procédure de tranchage elle-même peut causer des dommages aux tissus mécaniques qui pourraient compromettre les résultats obtenus. Cependant, les avantages réels des préparations de tranches cérébrales l’emportent encore sur leurs inconvénients, c’est pourquoi ils présentent une technique très appréciée et utilisée dans la recherche en neurosciences.

Les tranches cérébrales hippocampiques aiguës présentent une technique puissante et donc largement utilisée pour étudier les processus neuronaux d’un niveau moléculaire jusqu’à des études complexes de circuits cérébraux. Ceci est basé sur la neuroanatomie idéale de l’hippocampe qui peut être facilement préservée dans une préparation de tranche^18. Par conséquent, les tranches de cerveau hippocampal sont utilisées dans une grande variété de projets de recherche scientifique, y compris les dépistages^{de médicaments 17}, les études des propriétés neuronales et synaptiques impliquées dans les fonctions cognitives⁴⁰^,⁴¹, et les enquêtes sur les conditions pathologiques du cerveau¹⁴^,⁴²^,⁴³. Toutefois, un large éventail d’applications différentes provoque également un large éventail de protocoles disponibles de préparation des tranches qui peuvent différer dans divers paramètres, tels que les conditions de dissection et la coupe de l’orientation du plan, entre autres. Par conséquent, la question exacte de la recherche d’un projet scientifique doit être déterminée afin de choisir un protocole approprié de préparation des tranches.

L’hélico tissulaire présente l’une des plus anciennes techniques utilisées afin de préparer des tranches de cerveau hippocampal⁴⁴^,⁴⁵. Les principaux avantages de cette méthode de préparation incluent le faible coût de l’hélicoptère et l’utilisation rapide et facile^46. Cependant, les hachoirs de tissu causent le stress mécanique qui a comme résultat des changements morphologiques et la mort^{cellulaire 47.} En comparaison, le vibratome est une machine assez chère et le temps de préparation des tranches est considérablement augmenté ce qui pourrait avoir un impact sur la qualité de la tranche. Cependant, le vibratome offre habituellement une manière plus douce de séparer les tranches du tissu et permet de maintenir le cerveau bien refroidi et oxygéné au-dessus de la procédure entière d’isolement, améliorant de ce fait des propriétés de^{tranche 46.} Par conséquent, plusieurs groupes emploient standardment cette technique et ont proposé des protocoles pour la préparation des tranches hippocampiques aiguës de cerveau utilisant le vibratome^16,^30,^48. Alors que certains protocoles ne fournissent que quelques détails pour le tranchage lui-même, mais plutôt se concentrer sur une application spécifique de cette préparation tranche⁴⁸, d’autres fournissent des protocoles de tranche détaillée qui diffèrent dans le plan de coupe ou d’autres détails du protocole (par exemple, l’intégration agarose ou tranche / solutions de récupération) donnée dans cet article²⁷^,³⁰.

Le protocole décrit ici présente une méthode simple afin de préparer des tranches horizontales aiguës de haute qualité de cerveau de souris hippocampal de jeunes animaux. Le protocole est particulièrement utile pour préserver le chemin perforant (médial et latéral) qui présente la voie d’entrée hippocampale, qui projette du cortex entorhinal à l’hippocampe⁸^,⁴⁹^,⁵⁰. Les préparations transversales sagittales, coronal, ainsi que les préparations isolées de tranches transversales d’hippocampe ne préservent pas correctement le chemin perforant, qui provient principalement des couches II et V du cortex entorhinal et se projette dans plusieurs secteurs dans l’hippocampe^18. En raison du positionnement anatomique du cortex entorhinal par rapport à l’hippocampe, les tranches horizontales de cerveau sont une nécessité afin de maintenir les fibres perforantes entièrement intactes de chemin dans la préparation de tranche^31. En outre, le tranchage horizontal préserve idéalement les fibres moussus qui se projettent du gyrus bosselé aux neurones CA3 dans l’hippocampe⁹^,³⁰^,⁵⁰. Par conséquent, cette méthode de préparation est de grande valeur pour les études qui étudient les voies d’entrée hippocampal et les processus liés à la DG. En outre, ce protocole permet l’étude de la voie collatérale Schaffer⁵⁰. Cependant, les préparations sagittales et coronaires de tranche de cerveau sont plus couramment employées en étudiant des projections de fibre de CA3 à CA1, vraisemblablement en raison de leur temps légèrement plus rapide de préparation qui peut augmenter le risque d’obtenir des tranches de haute qualité. Néanmoins, les préparations horizontales de tranche hippocampale présentent un outil de recherche puissant puisqu’elle permet la conservation et l’investigation de toutes les voies hippocampal de fibre dans un hémisphère de tranche. Cela peut être particulièrement utile lorsque les réponses du circuit sont étudiées, par exemple, dans des enregistrements d’analyse d’électrodes multiples.

Une préoccupation majeure lors de la préparation des tranches de cerveau est la bonne préservation du tissu cérébral. Ceci est accompli par plusieurs étapes critiques dans notre protocole, y compris une dissection rapide, l’oxygénation et le refroidissement continus et suffisants du tissu, et la protection du tissu cérébral par l’utilisation de la méthode protectrice de coupe avec une solution de découpage à faible teneur en sodium et à haut saccharose³⁹^,⁵¹. Malgré le fait que le protocole décrit ici donne un taux de réussite d’environ 90%, des mesures de protection potentiellement supplémentaires pourraient être nécessaires lorsque vous travaillez avec des tissus dérivés d’animaux plus âgés ou génétiquement diversifiés ou lorsque vous essayez de préserver une population cellulaire spécifique. Plusieurs méthodes ont déjà été rapportées pour protéger les préparations sensibles de tissu cérébral. Ces méthodes comprennent l’utilisation de solutions de tranchage à base de NMDG pour réduire la perméation du sodium^52,l’utilisation de niveaux élevés de magnésium dans la solution de tranchage afin de bloquer l’activité des récepteurs NMDA⁵³, et l’utilisation prolongée de solutions protectrices également pendant la période^{de récupération 23}. Toutes ces mesures se traduira par une réduction de l’excitotoxicité. En outre, une perfusion trans-cardiale avec des solutions de protection contre la glace ACSF est souvent utilisée et nécessaire lorsque vous travaillez avec des animaux plus âgés²⁷.

Les tranches aiguës du cerveau hippocampal sont parfaitement adaptées et largement utilisées pour des études électrophysiologiques pour des raisons telles que les signaux d’amplitude élevée qui peuvent être obtenus à partir d’une tranche cérébrale aiguë relativement épaisse (300-500 μm), ce qui garantit un rapport signal/bruit^{élevé 11}. Les applications électrophysiologiques couramment utilisées comprennent des enregistrements extracellulaires sur le terrain et des enregistrements intracellulaires à cellules entières en mode tension ou courant. Afin d’acquérir des données électrophysiologiques de haute qualité, la santé des tranches est une préoccupation primordiale et peut être garantie en suivant strictement le protocole présenté. Toutefois, comme les préparations de tranches présentent une technique très sensible, un contrôle de qualité doit être régulièrement inclus avant le début de chaque expérience. Plusieurs paramètres peuvent être utilisés comme vérification de la qualité de la tranche et sont évalués de façon standard au moyen de courbes input-output et d’enregistrements fEPSP ou EPSC^{de base 19}. Néanmoins, il convient de noter que les propriétés électrophysiologiques sous-optimales peuvent résulter d’erreurs expérimentales telles que le positionnement des électrodes, l’orientation ou même des dommages et ne représentent pas seulement la santé de la tranche préparée. Par conséquent, il est conseillé d’effectuer des contrôles de qualité supplémentaires tels que la visualisation simple et l’évaluation des cellules sous un objectif de 40x ou une coloration du noyau DAPI. Ces contrôles de qualité peuvent être utilisés pour confirmer la santé constante des tranches au cours de plusieurs séances de préparation de tranches.

La microfluorimétrie calcique présente une technique moins couramment utilisée pour étudier les tranches de cerveau hippocampal. Cependant, cette technique est d’une valeur supplémentaire pour les enregistrements d’électrodes extracellulaires et intracellulaires standard, car elle permet de visualiser et de quantifier les flux intracellulaires de calcium, qui sont d’une grande importance dans la signalisation neuronale et synaptique. Les changements dans les concentrations intracellulaires de calcium sont impliqués dans la libération de vésicule de neurotransmetteur, la génération potentielle postsynaptique, la régulation de la plasticité synaptique et la conduction axonale^{de nerf 54,}^55,^56. À titre d’illustration de cette technique (figure 4), nous avons utilisé un colorant de calcium disponible dans le commerce. Incontestablement, le traitement des tranches de tissu avec des dyes de calcium peut produire des difficultés telles qu’un délai expérimental accru ainsi qu’une charge inefficace des cellules neuronales situées inférieures. Toutefois, des variations sur cette technique pourraient être utilisées pour contourner ces défis techniques. Par exemple, il est possible de combiner des mesures de calcium et des enregistrements de pince de correction dans les tranches hippocampal. De cette façon, un colorant fluorescent de calcium pourrait être chargé dans une cellule spécifique par la pipette de correction, permettant les mesures de la dynamique de calcium dans une cellule spécifique d’intérêt^57. Alternativement, les animaux génétiquement modifiés exprimant l’indicateur de calcium, GCaMP⁵⁸, soit dans le cerveau entier, ou entraînés par un promoteur spécifique à la cellule, pourraient être utilisés. Fait intéressant, les tissus cérébraux provenant d’animaux GCaMP ayant un lien direct avec une protéine d’intérêt pourraient fournir des occasions de déterminer le modèle d’expression neuronale ou d’étudier la participation aux étincelles et aux ondes calciques.

Au total, nous fournissons les lignes directrices pour la préparation réussie de tranches de cerveau hippocampal horizontales saines et viables provenant de souris pour des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie. Cette méthodologie est très utile pour accéder aux changements neurologiques qui se produisent dans les pathologies cérébrales qui sont décrites dans le gyrus bosselé.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions l’unité d’électrophysiologie du VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research sous la supervision du Dr Keimpe Wierda et du Professeur Joris De Wit pour l’utilisation de leurs installations de recherche. En outre, nous remercions tous les membres du Laboratoire de recherche Ion Channel et du Laboratoire d’Endomètre, d’Endométriose et de médecine de la reproduction à la KU Leuven pour leurs discussions et commentaires utiles.

Ce projet a reçu des fonds de la Fondation de recherche-Flandre (G.084515N et G.0B1819N à J.V.) et du Conseil de recherche de la KU Leuven (C14/18/106 à J.V.). K.P. est boursier FWO [PEGASUS]² Marie Skłodowska-Curie et a reçu des fonds du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie (665501) avec la Fondation flanders (FWO) (12T0317N). K.H. est boursier postdoctoral de la Research Foundation Flanders, Belgique (12U7918N).

Materials

Anesthesia chamber	home made – Generic	N/A	plexiglas
Anesthesia vaporizer	Dräger & MSS International Ltd	Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane	to vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion system	TERUMO	Hypodermic syringes without needle	https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodide	hellobio	HB0893	https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillaries	Science Products	GB150F-8P	https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrate	Merck	102382	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging software	Till Photonics	LiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tank	Air Liquide	Alphagaz mix B50	Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrode	FHC	CE2C55	https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm)	Corning Life Sciences	353001	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm)	Thermo Fisher Scientific	101VR20	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forceps	Fine Science tools	11270-20	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5	hellobio	HB0225	https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma Aldrich	16301	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS camera	HAMAMATSU	ORCA-spark C11440-36U	https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissors	Fine Science tools	14058-09	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQX	hellobio	HB0262	https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD camera	Andor	iXon TM + DU-897E-CSO-#BV	https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier	HEKA Elektronik	895278	https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paper	VWR	516-0818	grade 413
Fine brush	Raphael Kaerell	8204	Size #1
18G needle	Henke Sass Wolf Fine-Ject	18G X 1 1/2" 4710012040	https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
Isoflurane	Dechra Veterinary Products	Iso-Vet 1000mg/g	250 ml bottle
Loctite 406	Henkel Adhesive technologies	Loctite 406	Super glue
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-10 with SM-7 remote control system	https://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging)	Olympus	BX51WI	https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings)	Zeiss	Axio Examiner.A1	https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light source	CAIRN Research	dual OptoLed power supply	https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
Monochromator	Till Photonics	Polychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)	Sigma Aldrich	M3262	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1	Invitrogen Molecular Probes	#06807	10x50ug
Osmometer	Wescor	5500 vapor pressure osmometer	to verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	Masterflex C/L 77120-62	https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meter	WTW	inoLab series pH 720	https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette puller	Sutter Instrument	P-1000	https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chlorid	Chem-lab	CL00.1133	https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheres	SPI supplies	Safety Cartridge Dispenser – Pkg/10	GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratome	Ted Pella Inc	121-6	double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamber	home made – Generic	N/A	to collect and store brain slices in (see details in manuscript)
Scissors	Any company	N/A	Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wire	Any company		for recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merck	106342	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonate	Alfa Aesar	14707	https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chlorid	Fisher Scientific	S/3160/60	https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordings	HEKA Elektronik	PatchMaster	https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
Spatula	Sigma Aldrich	S9147-12EA	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
Stimulator	A.M.P.I	ISO-FLEX	http://www.ampi.co.il/isoflex.html
Sucrose	VWR International Ltd.	102745C	https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1	Warner Instruments	64-0167	Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2	Fisher Scientific	800/100/200 & 800/100/280	Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pump	home made – Generic	N/A
8 valve multi-barrel perfusion system	home made	N/A	consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines)	NResearch Inc.	p/n 161P011	https://nresearch.com/
Vibratome	Leica	14912000001	Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bath	Memmert	WNB 7	https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification system	Merck	Synergy millipore	to obtain highly purified water
12-well plates	Greiner Bio-One	CELLSTAR, 665180	http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf

References

Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
Cavarsan, C. F., Malheiros, J., Hamani, C., Najm, I., Covolan, L. Is mossy fiber sprouting a potential therapeutic target for epilepsy. Frontiers in Neurology. 9, 1023 (2018).
Nadler, J. V. The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain. Neurochemical Research. 28 (11), 1649-1658 (2003).
Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE translational task force of the ILAE. Epilepsia. 58, 40-52 (2017).
Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 神经科学. , 86-98 (2015).
Tohno, Y., et al. Relationships among the hippocampus, dentate gyrus, mammillary body, fornix, and anterior commissure from a viewpoint of elements. Biological Trace Element Research. 140 (1), 35-52 (2011).
Maclean, P. D. The limbic system and its hippocampal formation; studies in animals and their possible application to man. Journal of Neurosurgery. 11 (1), 29-44 (1954).
Petersen, R. P., et al. Electrophysiological identification of medial and lateral perforant path inputs to the dentate gyrus. 神经科学. 252, 154-168 (2013).
Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in Brain Research. 163, 3-22 (2007).
Szirmai, I., Buzsaki, G., Kamondi, A. 120 years of hippocampal schaffer collaterals. Hippocampus. 22 (7), 1508-1516 (2012).
Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visualized Experiments. (49), e2330 (2011).
Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining Acute Brain Slices. Bio-protocol. 8 (2), 2699 (2018).
Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
Lo, D. C., McAllister, A. K., Katz, L. C. Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13 (6), 1263-1268 (1994).
Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 758, 115-134 (2011).
Magalhaes, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 203 (2018).
Bliss, T., Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., O’Keefe, J. . The hippocampus book. , 37-114 (2007).
Bortolotto, Z. A., Amici, M., Anderson, W. W., Isaac, J. T. R., Collingridge, G. L. Synaptic plasticity in the hippocampal slice preparation. Current Protocols in Neuroscience. 54 (1), 11-26 (2011).
Al-Osta, I., et al. Imaging calcium in hippocampal presynaptic terminals with a ratiometric calcium sensor in a novel transgenic mouse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 209 (2018).
McLeod, F., Marzo, A., Podpolny, M., Galli, S., Salinas, P. Evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices. Journal of Visualized Experiments. (128), e56153 (2017).
Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).
Zhou, Q., Abe, H., Nowak, T. S. Immunocytochemical and in situ hybridization approaches to the optimization of brain slice preparations. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 85-92 (1995).
Koike-Tani, M., Tominaga, T., Oldenbourg, R., Tani, T. Birefringence changes of dendrites in mouse hippocampal slices revealed with polarizing microscopy. Biophysical Journal. 110 (10), 2366-2384 (2020).
Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
Hua, Y., Keep, R. F., Hoff, J. T., Xi, G. Brain injury after intracerebral hemorrhage: the role of thrombin and iron. Stroke. 38, 759-762 (2007).
Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).
Paxinos, G., Franklin, K. . The Mouse Brain In Stereotaxic Coordinates. 3 edn. , 256 (2008).
Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging. Journal of Visualized Experiments. (67), e4071 (2012).
Schauer, C., Leinders-Zufall, T. Imaging calcium responses in GFP-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (66), e4213 (2012).
Tetteh, H., Lee, J., Lee, J., Kim, J. G., Yang, S. Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording. Journal of Visualized Experiments. (150), e59879 (2019).
Smith, C. J., et al. Investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (69), e4411 (2012).
McNaughton, B. L. Evidence for two physiologically distinct perforant pathways to the fascia dentata. Brain Research. 199 (1), 1-19 (1980).
Colino, A., Malenka, R. C. Mechanisms underlying induction of long-term potentiation in rat medial and lateral perforant paths in vitro. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1150-1159 (1993).
Coulter, D. A., Carlson, G. C. Functional regulation of the dentate gyrus by GABA-mediated inhibition. Progress in Brain Research. 163, 235-243 (2007).
Kuenzi, F. M., Fitzjohn, S. M., Morton, R. A., Collingridge, G. L., Seabrook, G. R. Reduced long-term potentiation in hippocampal slices prepared using sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 117-122 (2000).
Connor, S. A., et al. Loss of synapse repressor MDGA1 enhances perisomatic inhibition, confers resistance to network excitation, and impairs cognitive function. Cell Reports. 21 (13), 3637-3645 (2017).
Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).
Moodley, K. K., Chan, D. The hippocampus in neurodegenerative disease. Frontiers of Neurology and Neuroscience. 34, 95-108 (2014).
Kong, H., et al. Inhibition of miR-181a-5p reduces astrocyte and microglia activation and oxidative stress by activating SIRT1 in immature rats with epilepsy. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. , (2020).
Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).
Wang, T., Kass, I. S. Preparation of brain slices. Methods in Molecular Biology. 72, 1-14 (1997).
Garthwaite, J., Woodhams, P. L., Collins, M. J., Balazs, R. On the preparation of brain slices: morphology and cyclic nucleotides. Brain Research. 173 (2), 373-377 (1979).
Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51706 (2014).
Aydin-Abidin, S., Abidin, &. #. 3. 0. 4. ;. 7,8-Dihydroxyflavone potentiates ongoing epileptiform activity in mice brain slices. Neuroscience Letters. 703, 25-31 (2019).
Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 107 (2017).
Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the use of brain slices. Progress in Neurobiology. 31 (1), 1-18 (1988).
Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 71 (15), 2787-2814 (2014).
Gleichmann, M., Mattson, M. P. Neuronal calcium homeostasis and dysregulation. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (7), 1261-1273 (2011).
Padamsey, Z., Foster, W. J., Emptage, N. J. Intracellular Ca(2+) release and synaptic plasticity: a tale of many stores. The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 25 (3), 208-226 (2019).
Chen-Engerer, H. J., et al. Two types of functionally distinct Ca2+ stores in hippocampal neurons. Nature Communications. 10 (1), 3223 (2019).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (163), e61753, doi:10.3791/61753 (2020).