MS2亲和力纯化与革兰阳性细菌中的RNA测序相结合

在大多数细菌基因组中，已经发现了数百种，甚至数千种小型调节RNA（SRNA），但其中绝大多数的功能仍然不寻常。总的来说，sRNA是短的非编码分子，在细菌生理学和适应波动环境^1，2，3中起着主要作用。事实上，这些大分子是众多复杂监管网络的中心，影响代谢途径、应激反应，但也影响毒性和抗生素耐药性。从逻辑上讲，它们的合成是由特定的环境刺激（例如营养饥饿、氧化或膜应力）触发的。大多数 sRNA 通过短和非连续基配对在转录后级别调节多个目标 mRNA。他们通常通过与核糖体竞争翻译启动区域⁴来阻止翻译的启动。sRNA：mRNA复式的形成也常常导致目标mRNA通过招募特定的RNA而主动退化。

sRNA 靶点（即其目标 RNA 的整组）的定性允许识别其干预的代谢通路及其回答的潜在信号。因此，特定 sRNA 的功能通常可以从其目标中推断出。为此，已经开发了几个西里科预测工具，如因塔纳和科普拉纳^5，6，7。它们特别依赖于序列互补性、配对能量和潜在交互站点的可访问性，以确定假定 sRNA 合作伙伴。但是，预测算法并不集成影响体内基础配对的所有因素，例如 RNA 陪护⁸的参与，这些因素有利于次优交互或双方的共同表达。由于其固有的局限性，预测工具的误报率仍然很高。大多数实验性的大规模方法是基于sRNA的共纯化：mRNA夫妇与标记RNA结合蛋白^{（RBP）6，9}相互作用。例如，通过利格化和测序（RIL-seq）方法识别出RNA复式与RNA伴郎（如大肠杆菌^10、11中的Hfq和ProQ）共同纯^化。一种类似的技术称为紫外线交叉链接，利化和混合测序（CLASH）被应用到大肠杆菌^12，13的RNA和Hfq相关sRNA。尽管Hfq和ProQ在多种细菌^8、14、15的sRNA介介调节中的作用十分突出，但在像S.Aureus^16、17、18这样的几个生物体中^，基于sRNA的调节似乎与RNA无关。即使像沃特斯和同事¹³所证明的那样，与RNA关联的RNA复式净化是可行的，但这种情况仍然很棘手，因为RNA会引发它们的快速退化。因此，MS2-亲和力纯化加上RNA测序（MAPS）方法^19，20构成了这种生物体的坚实替代品。

与上述方法不同，MAPS 使用特定的 sRNA 作为诱饵来捕获所有相互作用的RNA，因此不依赖于 RBP 的参与。整个过程在 图1中描述。简言之，sRNA 标记为 5′ 与 MS2 RNA 贴机，该贴子由 MS2 涂层蛋白特别识别。这种蛋白质与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合，固定在淀粉酶树脂上。因此，MS2-sRNA 及其 RNA 合作伙伴保留在亲和力色谱列中。与麦芽糖分离后，使用高通量RNA测序进行联合纯化RNA识别，然后进行生物信息分析（图2）。MAPS 技术最终绘制了一张内部发生的所有潜在交互的交互映射图。

MAPS技术最初是在非致病性革兰阴性大肠杆菌²¹中实施的。值得注意的是，MAPS 帮助识别了一个 tRNA 衍生片段，该片段与 RyhB 和 Rybb sRNA 特别交互，并防止任何 sRNA 转录噪声在非诱导条件下调节 mRNA 目标。此后，MAPS 已成功应用于其他大肠杆菌sRNA，如 DsrA^{22、RprA23、CyaR23}和 GcvB^24（表 1）。除了确认以前已知的目标外，MAPS 还扩展了这些众所周知的 sRNA 的目标范围。最近，MAPS已经在沙门氏菌蒂菲穆里姆进行，并透露，SraL sRNA绑定到rho mRNA，编码转录终止因子^25。通过这种配对，SraL 保护rho mRNA 免受由 Rho 本身触发的过早转录终止。有趣的是，该技术不限于 sRNA，可以应用于任何类型的蜂窝RNA，例如使用 tRNA 衍生的片段²⁶和 mRNA²²的 5’未翻译区域 （表 1）。

MAPS方法也已适应致病性革兰阳性细菌S.金黄色葡萄球菌^19。具体来说，裂解协议已被广泛修改，以有效地打破细胞，由于比Gram阴性细菌更厚的细胞壁，并保持RNA完整性。这个经过调整的协议已经解开了RSA27、RsaI²⁸和RSAC29的相互作用。这种方法深入了解了这些 sRNA 在细胞表面特性、葡萄糖吸收和氧化应激反应的调控机制中的关键作用。

2015年在 大肠杆菌 中制定和实施的协议最近被详细描述了^30。在这里，我们提供修改后的 MAPS 协议，该协议特别适合研究革兰阳性（较厚的细胞壁）细菌中的 sRNA 监管网络，无论是非致病细菌还是致病菌（安全预防措施）。