MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام
Summary
وقد تم تطوير تكنولوجيا MAPS للتدقيق في الهدف من الحمض النووي الريبي التنظيمية محددة في الجسم الحي. يتم وضع علامة على الحمض النووي الريبي من الفائدة مع aptamer MS2 تمكين تنقية مشتركة من شركائها الجيش الملكي النيبالي وتحديدها عن طريق تسلسل الجيش الملكي النيبالي. هذا البروتوكول المعدل مناسب بشكل خاص للبكتيريا إيجابية الغرام.
Abstract
على الرغم من أن الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير منتشر على نطاق واسع بين مجال الحياة البكتيري ، إلا أن وظائف العديد منها لا تزال سيئة الخصائص بشكل ملحوظ بسبب صعوبة تحديد أهدافها من الحمض النووي الريبي. هنا ، وصفنا بروتوكولا معدلا لتنقية MS2-Affinity إلى جانب تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي (MAPS) ، بهدف الكشف عن جميع شركاء الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي المحدد في الجسم الحي. على نطاق واسع ، يتم دمج MS2 aptamer إلى أقصى 5 ‘من الحمض النووي الريبي من الفائدة. ثم يتم التعبير عن هذا البناء في الجسم الحي ، مما يسمح ل MS2-sRNA بالتفاعل مع شركائها الخلويين. بعد الحصاد البكتيري ، يتم الخلايا ميكانيكيا. يتم تحميل استخراج الخام في عمود الكروماتوغرافيا القائمة على الأميلوز المغلفة سابقا مع البروتين MS2 تنصهر على البروتين ملزمة maltose. وهذا يتيح التقاط محددة من MS2-sRNA والتفاعل RNAs. بعد التحلل، يتم تحديد الحمض النووي الريبي المنقى من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية والتحليل المعلوماتي الحيوي اللاحق. وقد تم تنفيذ البروتوكول التالي في المكورات العنقودية العنقودية المسببة للأمراض البشرية إيجابية الغرام، وهو، من حيث المبدأ، قابلة للانقل إلى أي بكتيريا إيجابية الغرام. وخلاصة القول ، تشكل تكنولوجيا MAPS طريقة فعالة لاستكشاف الشبكة التنظيمية ل sRNA معين بعمق ، وتقدم لقطة من الهدف بأكمله. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الأهداف المفترضة التي حددتها الخرائط لا تزال بحاجة إلى التحقق من صحتها من خلال نهج تجريبية تكميلية.
Introduction
وقد تم تحديد المئات، وربما حتى الآلاف من الرنانات التنظيمية الصغيرة (sRNAs) في معظم الجينوم البكتيري، ولكن وظائف الغالبية العظمى منهم لا تزال غير مطهرة. عموما، SRNAs هي جزيئات قصيرة غير الترميز، ولعب أدوار رئيسية في علم وظائف الأعضاء البكتيرية والتكيف مع البيئات المتقلبة1،2،3. والواقع أن هذه الجزيئات الكبيرة هي في قلب العديد من الشبكات التنظيمية المعقدة، مما يؤثر على المسارات الأيضية، والاستجابات الإجهادية، ولكن أيضا فيوعة ومقاومة المضادات الحيوية. منطقيا، يتم تشغيل توليفها من قبل محفزات بيئة محددة (على سبيل المثال، المجاعة الغذائية، والأكسدة أو ضغوط الغشاء). وتنظم معظم الرنانات المريبة متعددة الأهداف على مستوى ما بعد النسخ من خلال الاقتران القاعدي القصير وغير المتجاور. وعادة ما تمنع بدء الترجمة من خلال التنافس مع الريبوسومات لمناطق بدء الترجمة4. تشكيل sRNA:mRNA دوبلس أيضا غالبا ما يؤدي إلى تدهور نشط من مرنا الهدف عن طريق تجنيد RNases محددة.
إن توصيف هدف الحمض النووي الريبي (أي المجموعة الكاملة من الحمض النووي الريبي المستهدف) يسمح بتحديد المسارات الأيضية التي يتدخل فيها والإشارة المحتملة التي يستجيب لها. وبالتالي، يمكن الاستدلال على وظائف الحمض النووي الريبي محددة عموما من targetome لها. لهذا الغرض، وقد وضعت عدة في أدوات التنبؤ سيليكو مثل IntaRNA وCopraRNA5،6،7. وهي تعتمد بشكل خاص على تكامل التسلسل، واقتران الطاقة وإمكانية الوصول إلى موقع التفاعل المحتمل لتحديد شركاء الحمض النووي الريبي المفترضين. ومع ذلك ، فإن خوارزميات التنبؤ لا تدمج جميع العوامل التي تؤثر على الاقتران الأساسي في الجسم الحي مثل مشاركة مرافقي الحمض النووي الريبي8 الذين يفضلون التفاعلات دون المستوى الأمثل أو التعبير المشترك لكلا الشريكين. ونظرا للقيود المتأصلة في هذه الأدوات، فإن المعدل الإيجابي الزائف لأدوات التنبؤ لا يزال مرتفعا. وتستند معظم النهج التجريبية على نطاق واسع على تنقية مشتركة من الأزواج sRNA:mRNA التفاعل مع بروتين ملزم الحمض النووي الريبي الموسومة (RBP)6,9. على سبيل المثال، التفاعل RNA عن طريق الربط والتسلسل (RIL-seq) طريقة تحديد الدوبلس الجيش الملكي النيبالي شارك في تنقيتها مع مرافقين الجيش الملكي النيبالي مثل Hfq و ProQ في الإشريكية القولونية10،11. تم تطبيق تقنية مماثلة تسمى UV-Crosslinking، ربط وتسلسل الهجينة (CLASH) على RNase E- وHFQ المرتبطة sRNAs في E. coli12،13. على الرغم من الأدوار الموصوفة جيدا من Hfq و ProQ في تنظيم SRNA بوساطة في البكتيريا المتعددة8،14،15، يبدو أن التنظيم القائم على الحمض النووي الريبي هو مرافق الحمض النووي الريبي المستقل في العديد من الكائنات الحية مثل S. aureus16،17،18. حتى لو كان تنقية الدوبلس الحمض النووي الريبي بالاشتراك مع RNases ممكن كما يتضح من ووترز وزملاء العمل13، وهذا لا يزال صعبا كما RNases تؤدي إلى تدهورها السريع. وبالتالي ، فإن تنقية MS2-Affinity إلى جانب نهج تسلسل الحمض النووي الريبي (MAPS)19،20 يشكل بديلا صلبا في مثل هذه الكائنات الحية.
على عكس الأساليب المذكورة أعلاه ، يستخدم MAPS حمضRNA محدد كطعم لالتقاط جميع الحمض النووي الريبي المتفاعل وبالتالي لا يعتمد على مشاركة RBP. يتم تصوير العملية بأكملها في الشكل 1. باختصار، يتم وضع علامة على الحمض النووي الريبي في 5 ‘مع APTAMER RNA MS2 التي يتم التعرف عليها على وجه التحديد من قبل بروتين معطف MS2. يتم دمج هذا البروتين مع البروتين ملزمة مالتوس (MBP) أن شلت على راتنج اميلوز. لذلك ، يتم الاحتفاظ MS2 – SRNA وشركائها الجيش الملكي النيبالي على العمود الكروماتوغرافي تقارب. بعد elution مع مالتوز، يتم تحديد الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الإنتاجية تليها التحليل المعلوماتية الحيوية(الشكل 2). ترسم تقنية MAPS في نهاية المطاف خريطة تفاعلية لجميع التفاعلات المحتملة التي تحدث في الجسم الحي.
تم تنفيذ تكنولوجيا MAPS في الأصل في البكتيريا غير المسببة للأمراض الغرام السلبية E. القولونية21. ومن اللافت للنظر أن MAPS ساعدت في تحديد جزء مشتق من الحمض النووي الريبي يتفاعل على وجه التحديد مع كل من RyhB وRybB sRNAs ويمنع أي ضوضاء نسخية من الحمض النووي الريبي لتنظيم أهداف الحمض النووي الريبي في ظروف غير محفزة. بعد ذلك، تم تطبيق MAPS بنجاح على غيرها من E. coli sRNAs مثل DsrA22، RprA23، CyaR23 و GcvB24 (الجدول 1). وبالإضافة إلى تأكيد الأهداف المعروفة سابقا، وسعت الخرائط الهدف من هذه الرنانات المعروفة. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ MAPS في السالمونيلا تيفيموريوم وكشفت أن SraL SRNA يربط إلى رو مرنا، والترميز لعامل إنهاء النسخ25. من خلال هذا الاقتران، SraL يحمي رو مرنا من إنهاء النسخ المبكر الناجم عن رو نفسها. ومن المثير للاهتمام أن هذه التكنولوجيا لا تقتصر على الحمض النووي الريبي ويمكن تطبيقها على أي نوع من الحمض النووي الريبي الخلوي كما يتضح من استخدام جزء مشتق من الحمض النووي الريبي26 ومنطقة غير مترجمة من 5’untranslated من مرنا22 (الجدول 1).
وقد تم تكييف طريقة MAPS أيضا إلى البكتيريا المسببة للأمراض إيجابية الغرام S. أوريوس19. على وجه التحديد ، تم تعديل بروتوكول التحلل على نطاق واسع لكسر الخلايا بكفاءة بسبب جدار خلية أكثر سمكا من البكتيريا السلبية الغرام والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. هذا البروتوكول تكييفها كشف بالفعل interactome من RsaA27، RsaI28 و RsaC29. أعطى هذا النهج رؤى حول الدور الحاسم لهذه الرنانات في الآليات التنظيمية لخصائص سطح الخلية ، وامتصاص الجلوكوز ، والاستجابات للإجهاد التأكسدي.
وقد وصف مؤخرا البروتوكول الذي تم تطويره وتنفيذه في الإشريكية القولونية في عام 2015 بتفصيل كبير30. هنا، ونحن نقدم بروتوكول MAPS المعدلة، والتي هي مناسبة بشكل خاص لدراسة الشبكات التنظيمية الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية غرام (جدار الخلية سمكا) سواء كانت غير مسببة للأمراض أو المسببة للأمراض (احتياطات السلامة).
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول معدل للبكتيريا إيجابية الغرام
تم تطوير البروتوكول الأولي لل MAPS لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي في الكائن الحي النموذجي E. coli20،30. هنا، ونحن نصف بروتوكول المعدلة التي هي مناسبة لتوصيف الشبكات التنظيمية التي تعتمد على الحمض النووي ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل “وكالة الأنباء الوطنية للريتشرش” (ANR، غرانت ANR-16-CE11-0007-01، RIBOSTAPH، و ANR-18-CE12-0025-04، كونوكو، للعلاقات العامة). كما تم نشره في إطار labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 و ANR-17-EURE-0023 (للعلاقات العامة) ، كتمويل من الدولة التي تديرها ANR كجزء من الاستثمارات للبرنامج المستقبلي. تم دعم DL من قبل برنامج أبحاث وابتكار أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 753137-SaRNAReg. وقد تم دعم العمل في مختبر E. Massé من خلال المنح التشغيلية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) ، والمعاهد الوطنية للصحة NIH فريق منحة R01 GM092830-06A1.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen – MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3′ external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
