Le cerveau aigu de souris tranche pour étudier l’activité spontanée de réseau hippocampal

La mesure électrophysiologique à partir de tranches hippocampiques vivantes in vitro est une approche expérimentale puissante avec de nombreux avantages. L’expérimentateur peut utiliser un microscope, des micromanipulateurs et un système d’enregistrement pour visualiser et recueillir directement les mesures des neurones individuels dans le tissu. Les tranches de tissu sont également très accessibles à la photostimulation ou à l’administration de médicaments pour des expériences optogénétiques, chimiogénétiques ou pharmacologiques.

Le réseau hippocampal génère une activité de population hautement synchrone in vivo, visible sous forme d’oscillations dans le potentiel extracellulaire du champ local^1,2,3,4,5. Des méthodes de tranche de cerveau ont été leveraged pour obtenir l’aperçu des mécanismes cellulaires et de circuit sous-jacents à ces oscillations neuronales de réseau. Les travaux de base de Maier et coll. ont démontré que des complexes pointus d’ondulation d’onde (SWRs) peuvent émerger spontanément dans des tranches de l’hippocampe ventral^6,7. Les études suivantes de plusieurs investigateurs ont graduellement élucidé beaucoup d’aspects des SWRs, y compris le rôle des neuromodulateurs en réglementant l’état de réseau de l’hippocampe^8,9,10 et les mécanismes synaptiques qui conduisent la réactivation in vitro des ensembles neuronaux précédemment actifs pendant le comportement in vivo^11. Les expériences de tranche de cerveau ont également fourni un aperçu de l’oscillation de gamme gamma (30-100 Hz), un état distinct de réseau hippocampal censé soutenir l’encodage de mémoire et le^{rappel 12,13.} Enfin, reconnaissant le rôle central de l’hippocampe et des structures associées dans la pathophysiologie de l’épilepsie du lobe temporal^14,15, les chercheurs ont utilisé des préparations de tranches hippocampiques pour étudier la génération et la propagation de l’activité épileptiforme. Carter et coll. ont démontré que les tranches combinées du cortex hippocampal-entorhinal préparées à partir d’animaux épileptiques chroniques peuvent générer spontanément des décharges épileptiformes in vitro¹⁶. Par la suite, Karlócai et coll. ont exploré les mécanismes sous-jacents aux rejets épileptiformes dans les tranches hippocampiques en utilisant du liquide céphalo-rachidien artificiel modifié (ACSF) avec des concentrations d’ion altérées (mg²⁺ réduit ou K⁺élevé) ou des médicaments ajoutés (4AP ou gabazine)¹⁷.

Les chercheurs ont mis au point de nombreuses approches de tranches hippocampiques qui diffèrent de façon clé : (1) la région de l’hippocampe contenue dans la tranche (dorsale, intermédiaire ou ventrale); (2) la présence ou l’absence de tissus extrahippocampal tels que le cortex entorhinal ; (3) l’orientation utilisée pour couper les tranches (coronale, sagittale, horizontale ou oblique); et (4) les conditions dans lesquelles le tissu est maintenu après le tranchage (immergé entièrement dans l’ACSF ou maintenu à l’interface de l’ACSF et de l’air humidifié et riche en carbogen).

Le choix de l’approche de tranchage à utiliser doit être déterminé par l’objectif expérimental. Par exemple, des tranches transversales ou coronaires de l’hippocampe dorsal maintenus dans des conditions submergées ont été employées très efficacement pour l’étude des circuits intrahippocampal et de la plasticité synaptique^18,19,20. Cependant, de telles préparations ne génèrent pas spontanément des oscillations réseau aussi facilement que les tranches de l’hippocampe ventral^21,22,23. Bien qu’un état d’activité persistante de SWR puisse être induit par la stimulation tétanos dans les tranches transversales de l’hippocampe dorsal et ventral^24,les SWRs spontanés sont plus facilement observés dans les tranches ventrales^7,25.

Une distinction physiologique et anatomique inhérente entre l’hippocampe dorsal et ventral est soutenue par des études exécutées in vivo et in vitro^26. Les enregistrements chez les rats ont indiqué des rythmes fortement cohérents de theta dans tout l’hippocampe dorsal et intermédiaire, pourtant la cohérence pauvre entre la région ventrale et le reste de l’hippocampe^27. Les RSF in vivo se propagent facilement entre l’hippocampe dorsal et intermédiaire, tandis que les RS qui proviennent de l’hippocampe ventral demeurent souvent^{locaux 28}. Les projections associationnelles provenant des neurones pyramidaux CA3 qui résident dans l’hippocampe dorsale et intermédiaire projettent de longues distances le long de l’axe longitudinal de l’hippocampe. Les projections de CA3 provenant de régions ventrales demeurent relativement locales et sont donc moins susceptibles d’être rompues au cours du processus de^{tranchage 29,30}. Les tranches ventrales peuvent donc mieux préserver le réseau récurrent nécessaire à la synchronisation de la population. La propension des tranches ventrales à générer des activités spontanées de réseau in vitro peut également refléter une excitabilité intrinsèque plus élevée des neurones pyramidaux ou une inhibition GABAergic plus faible dans l’hippocampe ventral par rapport aux régions plus dorsales³¹. En effet, les tranches hippocampales ventrales sont plus sensibles à l’activité épileptiforme^32,33. Ainsi, de nombreuses études sur les oscillations physiologiques^{spontanées 8,9,11,24} ou pathologiques^16,34,35,³⁶ oscillations réseau ont traditionnellement utilisé une approche horizontale de tranchage, parfois avec un léger angle dans la direction fronto-occipitale, qui donne des tranches de tissu parallèles au plan transversal de l’hippocampe ventral.

La connectivité réseau est inévitablement affectée par la procédure de tranchage car de nombreuses cellules de la tranche seront coupées. L’angle et l’épaisseur de la tranche et du tissu conservés dans la préparation doivent être considérés comme optimisant la connectivité dans les circuits d’intérêt. De nombreuses études ont utilisé des tranches horizontales combinées du cortex hippocampal-entorhinal (HEC) pour explorer les interactions entre les deux structures dans le contexte d’oscillations physiologiques ou pathologiques du réseau. Roth et coll. ont effectué des enregistrements doubles à partir du sous-champ CA1 de l’hippocampe et de la couche V du cortex entorhinal médial pour démontrer la propagation de l’activité swr par la tranche^{HEC 37}. Beaucoup d’études de l’activité épileptiforme ont employé la préparation de tranche de HEC pour étudier comment les décharges épileptiformes propagent par le réseau corticohippocampal^16,35,36,38. Il est important de noter que la conservation de la boucle corticohippocampal intacte n’est pas une condition préalable pour des SWRs spontanés, des décharges épileptiformes, ou des oscillations gamma ; les oscillations réseau peuvent être générées en tranches transversales de l’hippocampe dorsal ou ventral sans tissus parahippocampal attachés^{21,22,23, 25,39,40,41}. Un facteur plus important pour la génération spontanée d’oscillations réseau en tranches hippocampiques peut être l’épaisseur de chaque tranche, car une tranche plus épaisse (400-550 μm) préservera plus de connectivité dans le réseau récurrent CA2/CA3^21,22,25.

Bien que des tranches horizontales inclinées de HEC (coupées avec un angle d’approximativement 12° dans la direction fronto-occipital) aient été employées pour étudier la connectivité fonctionnelle de la boucle corticohippocampal^{11,16,34,35,42,}de telles préparations inclinées ne sont pas exigées pour l’activité spontanée de réseau^43,44,45. Toutefois, l’utilisation d’un plan de découpage incliné permet à l’enquêteur de faire sélectivement des tranches qui préservent le mieux les lamellae orientées transversalement de l’hippocampe ventral ou intermédiaire, selon qu’un angle vers le bas ou vers le haut est appliqué (figure 1). Cette approche est conceptuellement semblable à celle utilisée par Papatheodoropoulos et coll., 2002, qui ont disséqué chaque hippocampe librement, puis utilisé un hachoir de tissu pour créer des tranches transversales le long de l’axe dorsal-ventral^{entier 21}. À la lumière des distinctions fonctionnelles susmentionnées entre l’hippocampe ventral et dorsale-intermédiaire, les chercheurs devraient tenir compte de l’origine anatomique des tranches lors de la conception d’expériences ou de l’interprétation des résultats. L’utilisation d’une rampe d’agar pendant la procédure de tranchage est un moyen simple de produire préférentiellement des tranches de l’hippocampe intermédiaire ou ventral.

Les tranches hippocampiques peuvent être maintenues soit dans une chambre submergée (avec le tissu complètement immergé dans l’ACSF), soit dans une chambre de style interface (par exemple, chambre Oslo ou Haas, avec des tranches couvertes uniquement par un mince film de médias fluides). L’entretien de l’interface améliore l’oxygénation du tissu, ce qui favorise la survie neuronale et permet des niveaux élevés soutenus d’activité interuronale. Traditionnellement, les conditions d’enregistrement submergées utilisent un débit ACSF plus lent qui ne fournit pas une oxygénation adéquate des tissus pour l’expression stable des oscillations au niveau du réseau. Dans les tranches hippocampales submergées, les oscillations gamma induites par le carbachol ne sont observées que^{transitoirement 46,47}, alors qu’elles peuvent être maintenues de façon durable dans les chambres d’enregistrement^{d’interface 10,48,49}. En tant que tel, de nombreuses études de l’activité spontanée complexe in vitro se sont appuyées sur des chambres d’enregistrement d’interface pour étudier les complexes d’ondulation à ondes vives^{6,7,8,9,10,25},³⁷, oscillations gamma^10,13, et l’activité épileptiforme^16,38,45,47.

Dans une chambre d’enregistrement de style immergé, un objectif de microscope d’immersion peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et cibler sélectivement les cellules d’aspect sain pour les enregistrements. La préparation submergée permet également un contrôle fin sur le milieu cellulaire, car la submersion facilite la diffusion rapide de médicaments ou d’autres composés dans le tissu. Ainsi, une méthodologie modifiée dans laquelle les oscillations stables du réseau sont maintenues dans des conditions submergées représente une approche expérimentale puissante. Cette approche est illustrée par le travail de Hájos et coll., dans lequel les tranches hippocampiques se rétablissent dans une chambre de détention simplifiée de style interface pendant plusieurs heures avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée modifiée avec un débit élevé d’ACSF (~6 mL/min) pour améliorer l’approvisionnement^{en oxygène du tissu 12,48,49}. Dans ces conditions, des niveaux élevés d’activité interneuronale et des oscillations spontanées stables du réseau peuvent être maintenus dans une chambre d’enregistrement submergée. Cette approche modifiée permet aux chercheurs d’effectuer des enregistrements de pinces à patch à cellules entières guidées visuellement et de caractériser la contribution des types de cellules morphologiquement identifiés aux oscillations gamma induites par le carbachol¹². Les RSR peuvent également se produire spontanément dans des tranches hippocampiques submergées avec un débit rapide de^11,48,49. Maier et coll. ont démontré que les tranches hippocampiques qui se sont rétablies dans une chambre d’interface avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée présentaient de façon fiable des RS spontanés, tandis que les tranches qui se rétablissaient immergées dans un bécher avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée montraient des réponses plus petites sur le terrain évoquées, des niveaux inférieurs de courants synaptiques spontanés et seulement très rarement des SWR^{spontanés 43}. Schlingloff et coll. ont utilisé cette méthodologie améliorée pour démontrer le rôle des cellules paniers exprimant la parvalbumine dans la génération de SRS^{spontanés 44}.

Le protocole suivant présente une méthode de tranchage par laquelle les neurones spontanément actifs dans les tranches hippocampiques horizontales peuvent être récupérés dans des conditions d’interface et ensuite maintenus dans une chambre d’enregistrement submergée adaptée aux manipulations pharmacologiques ou optogénétiques et aux enregistrements visuellement guidés.