Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

La transcripción y traducción de genes son los dos principales procesos implicados en el dogma central de la biología, pasando de la secuencia de ADN al ARN y a la proteína^1. En este estudio, nos centramos en la producción de ARN mensajero (ARNm) durante la transcripción. La molécula de ARN naciente incluye tanto intrones no codificantes como exones codificantes. Los intrones se empalman co-transcripcionalmente antes de que el ARNm se mueva hacia el citoplasma para su traducción en los ribosomas^2,3.

Tradicionalmente, la medición de ARNm se realiza en poblaciones masivas de células (cientos a millones) con ensayos clásicos como RT-qPCR o Northern blotting. Si bien son muy poderosos, estos métodos son limitados, ya que no proporcionan información sobre la variación de célula a célula (heterogeneidad fenotípica), la identificación del número de alelos transcripcionalmente activos y, quizás lo más importante, carecen de información espacial. Más recientemente, las tecnologías de todo el genoma que permiten la secuenciación de ARN de una sola célula (RNAseq) comenzaron a cerrar la brecha entre los métodos de imagen y la secuenciación⁴. Sin embargo, RNAseq sufre de eficiencias de detección relativamente bajas y los pasos de procesamiento resultan en una pérdida completa de información espacial⁵. Aunque RNAseq de una sola célula puede proporcionar información sobre la heterogeneidad fenotípica entre una población de células isogénicas, la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (RNA-FISH) puede facilitar una exploración más completa de la expresión génica objetivo a nivel espacial, y sobre una base de alelo por alelo^6,7.

RNA FISH es una técnica que permite la detección y localización de moléculas de ARN diana en células fijas. A diferencia de los métodos anteriores y laboriosos, el RNA-FISH actual de última generación utiliza sondas de ácido nucleico disponibles comercialmente que son complementarias a las secuencias de ARN objetivo, y estas sondas se hibridan a sus objetivos mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick⁸. Las primeras técnicas de hibridación in situ implicaron un protocolo similar establecido por Gall y Pardue en 1969, ya que una muestra se procesó con sondas de ácido nucleico que se hibridaron específicamente a un ARN objetivo^9. Originalmente el ensayo se realizaba mediante detección radiactiva o colorimétrica; sin embargo, en la década de 1980, el desarrollo de protocolos de hibridación fluorescente in situ (FISH) para ADN FISH y más tarde ARN FISH abrió la ruta hacia una detección más sensible, y el potencial de multiplexación^10,11.

Otros desarrollos en RNA FISH han llevado a la capacidad de detectar y cuantificar moléculas individuales de ARN (smFISH)^12,13. La detección directa es un método en el que las sondas mismas se etiquetan con fluoróforos. Un desafío con smFISH es que existe la necesidad de suficientes sondas de hibridación / objetivo para facilitar la detección de señales fluorescentes como puntos distintos y limitados por difracción. Para abordar este problema, se puede utilizar un conjunto de sondas de oligonucleótidos cortos de ADN monocatenario complementarios a varias regiones del ARN objetivo^8,12,14. La unión de múltiples sondas aumenta la densidad del fluoróforo local, haciendo que el ARN sea visible como un punto distinto de alta intensidad mediante microscopía de fluorescencia. Este método es ventajoso porque la unión fuera del objetivo de los oligonucleótidos en el conjunto de sondas puede distinguirse de la verdadera señal puntual de ARN mediante el análisis cuantitativo del tamaño y la intensidad del punto para diferenciar entre la señal verdadera y la unión espuria a oligonucleótidos, facilitando así un análisis más preciso al reducir los falsos positivos¹².

Los métodos alternativos para detectar arNm son el método clásico de traducción de nick basado en clones de BAC y el sistema de ADN ramificado desarrollado más recientemente. En el método de traducción de nick clonado por BAC, el ADN a etiquetar se corta enzimáticamente y se agrega un nuevo nucleótido al extremo 3′ expuesto. La actividad de la ADN polimerasa I añade un nucleótido etiquetado dando como resultado la sonda deseada^15,16. La técnica de ADN ramificado involucra sondas de oligonucleótidos que se hibridan en pares con objetivos de ARN y estas sondas se amplifican utilizando múltiples moléculas de amplificación de señal. Este método puede mejorar significativamente la relación señal-ruido, pero la amplificación puede sesgar la cuantificación precisa ya que los puntos fluorescentes pueden ser muy diferentes en tamaño e intensidad¹⁷.

Como sistema modelo para este protocolo, que se emplea completamente como parte de la participación del Programa de Investigación Superfund de NIEHS para cuantificar los efectos de los productos químicos disruptores endocrinos en Galveston Bay / Houston Ship Channel, utilizamos la línea celular de cáncer de mama MCF-7 con receptor de estrógeno (ER) positivo tratada durante la noche con un agonista de ER, 17β-estradiol (E2)^7,18,19. E2 regula muchos genes diana ER, incluyendo el gen prototípico ER-diana, GREB1^7,20,21,22. El protocolo smFISH descrito aquí utiliza un conjunto de dos conjuntos de sondas separados espectralmente dirigidos a GREB1; uno que se hibrida a exones y el otro a intrones, permitiendo la medición de ARN⁷maduro y naciente. Luego utilizamos microscopía de epifluorescencia junto con la deconvolución para obtener imágenes de muestras etiquetadas con smFISH, y luego aplicamos rutinas de análisis de imágenes para cuantificar el número de alelos activos y ARN maduros por célula.