Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

La trascrizione e la traduzione genica sono i due principali processi coinvolti nel dogma centrale della biologia, che vanno dalla sequenza del DNA all’RNA alla proteina¹. In questo studio, ci concentriamo sulla produzione di RNA messaggero (mRNA) durante la trascrizione. La nascente molecola di RNA comprende sia introni non codificanti che esoni codificanti. Gli introni vengono splicati co-trascrizionalmente prima che l’mRNA si muova nel citoplasma per la traduzione sui ribosomi^2,3.

Tradizionalmente, la misurazione dell’mRNA viene eseguita in popolazioni di massa di cellule (da centinaia a milioni) con saggi classici come RT-qPCR o Northern blotting. Sebbene molto potenti, questi metodi sono limitati in quanto non forniscono informazioni sulla variazione da cellula a cellula (eterogeneità fenotipica), sull’identificazione del numero di alleli trascrizionalmente attivi e, forse ancora più importante, mancano di informazioni spaziali. Più recentemente, le tecnologie a livello di genoma che consentono il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (RNAseq) hanno iniziato a colmare il divario tra i metodi di imaging e il sequenziamento⁴. Tuttavia, RNAseq soffre di efficienze di rilevamento relativamente basse e le fasi di elaborazione comportano la completa perdita di informazioni spaziali⁵. Sebbene l’RNAseq a singola cellula possa fornire informazioni sull’eterogeneità fenotipica tra una popolazione di cellule isogeniche, l’ibridazione in situ a fluorescenza dell’RNA (RNA-FISH) può facilitare un’esplorazione più completa dell’espressione genica bersaglio a livello spaziale e su base allele-per-allele^6,7.

RNA FISH è una tecnica che consente il rilevamento e la localizzazione di molecole di RNA bersaglio in cellule fisse. A differenza dei metodi precedenti e laboriosi, l’attuale RNA-FISH all’avanguardia utilizza sonde di acidi nucleici disponibili in commercio che sono complementari alle sequenze di RNA bersaglio e queste sonde si ibridano ai loro bersagli mediante l’accoppiamento di basi Watson-Crick⁸. Le prime tecniche di ibridazione in situ hanno coinvolto un protocollo simile stabilito da Gall e Pardue nel 1969, poiché un campione è stato elaborato con sonde di acido nucleico che si sono specificamente ibridate a un RNA^{bersaglio 9}. Originariamente il test è stato eseguito utilizzando la rilevazione radioattiva o colorimetrica; tuttavia, nel 1980, lo sviluppo di protocolli di ibridazione fluorescente in situ (FISH) a DNA FISH e successivamente RNA FISH ha aperto la strada verso il rilevamento più sensibile e il potenziale per il multiplexing^10,11.

Ulteriori sviluppi nell’RNA FISH hanno portato alla capacità di rilevare e quantificare singole molecole di RNA (smFISH)^12,13. Il rilevamento diretto è un metodo in cui le sonde stesse sono etichettate con fluorofori. Una sfida con smFISH è che c’è bisogno di abbastanza sonde / bersaglio ibridanti per facilitare il rilevamento di segnali fluorescenti come punti distinti e limitati dalla diffrazione. Per affrontare questo problema, si può usare un set di sonde di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento brevi complementari a varie regioni dell’RNA bersaglio^8,12,14. Il legame di più sonde aumenta la densità del fluoroforo locale, rendendo l’RNA visibile come un punto distinto ad alta intensità mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo è vantaggioso perché il legame off-target degli oligonucleotidi nel pool del set di sonde può essere distinto dal vero segnale spot dell’RNA analizzando quantitativamente la dimensione e l’intensità dello spot per distinguere tra segnale reale e legame oligonucleotidico spurio, facilitando così un’analisi più accurata riducendo i falsi positivi¹².

Metodi alternativi per rilevare l’mRNA sono il classico metodo di traduzione nick basato su clone BAC e il sistema di DNA ramificato di più recente sviluppo. Nel metodo di traduzione nick clonato con BAC, il DNA da etichettare viene inciso enzimaticamente e un nuovo nucleotide viene aggiunto all’estremità esposta di 3′. L’attività della DNA polimerasi I aggiunge un nucleotide etichettato risultando nella sonda desiderata^15,16. La tecnica del DNA ramificato coinvolge sonde oligonucleotidiche che si ibridano in coppie a bersagli di RNA e queste sonde sono amplificate utilizzando più molecole di amplificazione del segnale. Questo metodo può migliorare significativamente il rapporto segnale-rumore, ma l’amplificazione può distorcere la quantificazione accurata poiché i punti fluorescenti possono essere molto diversi per dimensioni e intensità¹⁷.

Come sistema modello per questo protocollo, che è pienamente impiegato come parte della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program per quantificare gli effetti delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino a Galveston Bay / Houston Ship Channel, abbiamo utilizzato la linea cellulare positiva al cancro al seno del recettore degli estrogeni (ER) MCF-7 trattata durante la notte con un agonista ER, 17β-estradiolo (E2)^7,18,19. E2 regola molti geni bersaglio ER, tra cui il prototipo del gene bersaglio ER, GREB1^7,20,21,22. Il protocollo smFISH qui descritto utilizza un set di due set di sonde separati spettralmente mirati a GREB1; uno che si ibrida agli esoni e l’altro agli introni, consentendo la misurazione dell’RNA⁷sia maturo che nascente. Usiamo quindi la microscopia a epifluorescenza accoppiata con la deconvoluzione per l’immagine di campioni etichettati smFISH e quindi applichiamo routine di analisi delle immagini per quantificare il numero di alleli attivi e RNA maturi per cellula.