Analyse unicellulaire d’allèles transcriptionnellement actifs par molécule unique FISH

La transcription et la traduction des gènes sont les deux processus majeurs impliqués dans le dogme central de la biologie, allant de la séquence d’ADN à l’ARN en passant par la protéine^1. Dans cette étude, nous nous concentrons sur la production d’ARN messager (ARNm) pendant la transcription. La molécule d’ARN naissante comprend à la fois des introns non codants et des exons codants. Les introns sont épissés co-transcriptionnellement avant que l’ARNm ne se déplace dans le cytoplasme pour être traduit sur les ribosomes^2,3.

Traditionnellement, la mesure de l’ARNm est effectuée dans des populations de cellules en vrac (des centaines à des millions) avec des tests classiques tels que la RT-qPCR ou le Northern blotting. Bien que très puissantes, ces méthodes sont limitées car elles ne fournissent pas d’informations sur la variation de cellule à cellule (hétérogénéité phénotypique), l’identification du nombre d’allèles transcriptionnellement actifs et, peut-être plus important encore, manquent d’informations spatiales. Plus récemment, les technologies à l’échelle du génome permettant le séquençage de l’ARN unicellulaire (RNAseq) ont commencé à combler le fossé entre les méthodes d’imagerie et le séquençage⁴. Cependant, RNAseq souffre d’une efficacité de détection relativement faible et les étapes de traitement entraînent une perte complète d’informations^{spatiales 5}. Bien que l’ARNAseq unicellulaire puisse fournir des informations sur l’hétérogénéité phénotypique au sein d’une population de cellules isogéniques, l’hybridation in situ par fluorescence d’ARN (ARN-FISH) peut faciliter une exploration plus complète de l’expression des gènes cibles au niveau spatial, et sur une base allèle par allèle^6,7.

RNA FISH est une technique qui permet la détection et la localisation de molécules d’ARN cibles dans des cellules fixes. Contrairement aux méthodes laborieuses antérieures, RNA-FISH, actuellement à la pointe de la technologie, utilise des sondes d’acide nucléique disponibles dans le commerce qui sont complémentaires aux séquences d’ARN cibles, et ces sondes s’hybrident à leurs cibles par appariement de base Watson-Crick⁸. Les premières techniques d’hybridation in situ impliquaient un protocole similaire établi par Gall et Pardue en 1969, car un échantillon était traité avec des sondes d’acide nucléique qui s’hybridaient spécifiquement en un ARN cible^9. À l’origine, le test était effectué à l’aide d’une détection radioactive ou colorimétrique; cependant, dans les années 1980, le développement de protocoles d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) à l’ADN FISH et plus tard à l’ARN FISH a ouvert la voie à une détection plus sensible et au potentiel de multiplexage^10,11.

D’autres développements dans l’ARN FISH ont conduit à la capacité de détecter et de quantifier des molécules d’ARN uniques (smFISH)^12,13. La détection directe est une méthode dans laquelle les sondes elles-mêmes sont étiquetées avec des fluorophores. Un défi avec smFISH est qu’il est nécessaire d’avoir suffisamment de sondes / cibles hybridantes pour faciliter la détection des signaux fluorescents en tant que points distincts et limités par diffraction. Pour résoudre ce problème, on peut utiliser un ensemble de sondes d’oligonucléotides d’ADN simple brin courts complémentaires à diverses régions de l’ARN cible^8,12,14. La liaison de plusieurs sondes augmente la densité locale des fluorophores, rendant l’ARN visible comme un point distinct de haute intensité par microscopie à fluorescence. Cette méthode est avantageuse car la liaison hors cible des oligonucléotides dans le pool d’ensembles de sondes peut être distinguée du signal spot d’ARN véritable en analysant quantitativement la taille et l’intensité des points pour différencier le signal réel et la liaison fausse aux oligonucléotides, facilitant ainsi une analyse plus précise en réduisant les faux positifs¹².

Les méthodes alternatives pour détecter l’ARNm sont la méthode classique de traduction des entailles basée sur le clone BAC et le système d’ADN ramifié plus récemment développé. Dans la méthode de traduction par entaille clonée au BAC, l’ADN à étiqueter est entaillé enzymatiquement et un nouveau nucléotide est ajouté à l’extrémité 3′ exposée. L’activité de l’ADN polymérase I ajoute un nucléotide marqué résultant en la sonde souhaitée^15,16. La technique de l’ADN ramifié implique des sondes d’oligonucléotides qui s’hybrident par paires avec des cibles d’ARN et ces sondes sont amplifiées à l’aide de plusieurs molécules d’amplification du signal. Cette méthode peut améliorer considérablement le rapport signal/bruit, mais l’amplification peut fausser la quantification précise puisque les taches fluorescentes peuvent être très différentes en taille et en intensité¹⁷.

En tant que système modèle pour ce protocole, qui est pleinement utilisé dans le cadre de la participation au programme de recherche NIEHS Superfund pour quantifier les effets des perturbateurs endocriniens dans Galveston Bay / Houston Ship Channel, nous avons utilisé la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein MCF-7 positive au récepteur des œstrogènes (ER) traitée pendant la nuit avec un agoniste ER, le 17β-estradiol (E2)^7,18,19. E2 régule de nombreux gènes cibles ER, y compris le gène prototype ER-cible, GREB1^7,20,21,22. Le protocole smFISH décrit ici utilise un ensemble de deux ensembles de sondes séparés spectralement ciblant GREB1; l’un qui s’hybride en exons et l’autre en introns, permettant la mesure de l’ARN⁷mature et naissant. Nous utilisons ensuite la microscopie à épifluorescence couplée à la déconvolution pour imager des échantillons marqués smFISH, puis appliquons des routines d’analyse d’images pour quantifier le nombre d’allèles actifs et d’ARN matures par cellule.