Genetisk variantdetektering i CALR-genen med hjälp av högupplöst smältanalys
Summary
Högupplöst smältanalys (HRM) är en känslig och snabb lösning för genetisk variantdetektering. Det beror på sekvensskillnader som resulterar i att heteroduplex ändrar smältkurvans form. Genom att kamma HRM och agarose gel elektrofores kan olika typer av genetiska varianter såsom indels identifieras.
Abstract
Högupplöst smältanalys (HRM) är en kraftfull metod för genotypning och genetisk variationsskanning. De flesta HRM-applikationer är beroende av mättande DNA-färgämnen som upptäcker sekvensskillnader och heteroduplex som ändrar smältkurvans form. Utmärkt instrumentupplösning och speciell dataanalysprogramvara behövs för att identifiera de små smältkurvorna som identifierar en variant eller genotyp. Olika typer av genetiska varianter med olika frekvenser kan observeras i genen specifikt för patienter med en specifik sjukdom, särskilt cancer och i CALR genen hos patienter med Philadelphia kromosom-negativa myeloproliferative tumörer. Enstaka nukleotidförändringar, införanden och/eller borttagningar (indels) i den av intressegenen kan detekteras genom HRM-analysen. Identifieringen av olika typer av genetiska varianter baseras främst på de kontroller som används i qPCR HRM-analysen. Men när produktlängden ökar blir skillnaden mellan vildtyp och heterozygotkurvor mindre, och typen av genetisk variant är svårare att bestämma. Därför, där indels är den utbredda genetiska varianten som förväntas i den gen av intresse, kan en ytterligare metod såsom agarose gel elektrofores användas för att klargöra HRM-resultatet. I vissa fall måste ett ofullständigt resultat kontrolleras/omdiagnostiseras genom standard Sanger-sekvensering. I denna retrospektiva studie tillämpade vi metoden på JAK2 V617F-negativa patienter med MPN.
Introduction
Somatiska genetiska varianter i calreticulin genen(CALR) erkändes 2013 hos patienter med myeloproliferative tumörer (MPN) såsom essentiell trombocytemi och primär myelofibrosis1,2. Sedan dess har mer än 50 genetiska varianter i CALR-genen upptäckts, vilket inducerar en +1 (−1+2) frameshift3. De två vanligaste genetiska varianterna av CALR är en 52 bp borttagning (NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs *46)), även kallad typ 1 mutation, och en 5 bp insättning (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs *47)), även kallad typ 2 mutation. Dessa två genetiska varianter representerar 80% av alla CALR genetiska varianter. De andra har klassificerats som typ 1-liknande eller typ 2-liknande med hjälp av algoritmer baserade på bevarandet av en α spiral nära vild typ CALR4. Här presenterar vi en av de mycket känsliga och snabba metoderna för CALR genetisk variantdetektering, den högupplösta smältanalysmetoden (HRM). Denna metod möjliggör snabb detektion av genetiska varianter av typ 1 och typ 2, som representerar majoriteten av CALR-mutationer 5. HRM introducerades i kombination med realtid »polymeraskedjereaktion« (qPCR) 1997 som ett verktyg för att upptäcka mutationen i faktor V Leiden6. I jämförelse med Sanger sekvensering som representerar den gyllene standardtekniken är HRM en känsligare och mindre specifik metod5. HRM-metoden är en bra screeningmetod som möjliggör en snabb analys av ett stort antal prover med en stor kostnads-nyttodel5. Det är en enkel PCR-metod som utförs i närvaro av ett fluorescerande färgämne och kräver inte specifika färdigheter. En annan fördel är att själva proceduren inte skadar eller förstör det analyserade provet som gör att vi kan återanvända provet för elektrofores eller Sanger-sekvensering efter HRM-proceduren7. Den enda nackdelen är att det ibland är svårt att tolka resultaten. HRM detekterar inte heller den exakta mutationen hos patienter med mutationer av icke-typ 1 eller typ 28. Hos dessa patienter ska Sanger-sekvensering utföras (figur 1).
HRM är baserad på förstärkning av den specifika DNA-regionen i närvaro av mättande DNA-fluorescerande färgämne, som ingår i dubbelsträngat DNA (dsDNA). Det fluorescerande färgämnet avger ljus när det ingår i dsDNA. Efter en progressiv temperaturökning bryts dsDNA ner i enkelsträngat DNA, vilket kan detekteras på smältkurvan som en plötslig minskning av fluorescensintensiteten. Smältkurvans form beror på den DNA-sekvens som används för att upptäcka mutationen. Smältkurvor av prover jämförs med smältkurvor av kända mutationer eller vild typ CALR. Distinkta smältkurvor representerar en annan mutation som inte är typ 1 eller typ 29.
Algoritmen för somatisk genetisk variantdetektering i CALR-genen genom HRM, agarose gel elektrofores och sekvenseringsmetod (figur 1) användes och validerades i den retrospektiva studien publicerad före10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Högupplöst smältning av DNA är en enkel lösning för genotypning och genetisk variantskanning14. Det beror på sekvensskillnader som resulterar i heteroduplex som ändrar smältkurvans form. Olika typer av genetiska varianter med olika frekvenser kan observeras i genen specifik för en viss grupp patienter med cancer1,2,15,16,10. B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka alla akademiska experter och anställda vid Specialized Hematology Laboratory, Institutionen för hematologi, avdelningen för internmedicin, University Medical Centre Ljubljana.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
