Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose
Summary
Dit protocol biedt methoden voor visualisatie van bacteriële cellen en polysaccharidesyntheselocus (Psl) polysaccharide in het sputum van cystische fibrosepatiënten.
Abstract
Vroege opsporing en uitroeiing van Pseudomonas aeruginosa in de longen van patiënten met cystische fibrose kan de kans op het ontwikkelen van een chronische infectie verminderen. De ontwikkeling van chronische P. aeruginosa-infecties gaat gepaard met een afname van de longfunctie en verhoogde morbiditeit. Daarom is er een groot belang bij het ophelderen van de redenen voor het niet uitroeien van P. aeruginosa met antibiotische therapie, die voorkomt bij ongeveer 10-40% van de pediatrische patiënten. Een van de vele factoren die van invloed kunnen zijn op de klaring van P. aeruginosa door de gastheer en de gevoeligheid voor antibiotica, zijn variaties in ruimtelijke organisatie (zoals aggregatie of biofilmvorming) en polysaccharideproductie. Daarom waren we geïnteresseerd in het visualiseren van de in situ kenmerken van P. aeruginosa in het sputum van CF-patiënten. Een weefselopruimingstechniek werd toegepast op sputummonsters na het inbedden van de monsters in een hydrogelmatrix om de 3D-structuren ten opzichte van gastheercellen te behouden. Na het opruimen van het weefsel werden fluorescerende labels en kleurstoffen toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken. Fluorescentie in situ hybridisatie werd uitgevoerd voor de visualisatie van bacteriële cellen, binding van fluorescerend gelabelde anti-Psl-antilichamen voor de visualisatie van het exopolysaccharide en DAPI-kleuring om gastheercellen te kleuren om structureel inzicht te verkrijgen. Deze methoden maakten het mogelijk om P. aeruginosa met hoge resolutie in het sputum van CF-patiënten te impliceren via confocale laserscanmicroscopie.
Introduction
In deze studie werden experimenten ontworpen om de in vivo structuur van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van pediatrische cystische fibrose (CF) patiënten te visualiseren. P. aeruginosa-infecties worden chronisch bij 30-40% van de pediatrische CF-populatie; Als chronische infecties eenmaal zijn vastgesteld, zijn ze bijna onmogelijk te elimineren1. P. aeruginosa-isolaten van patiënten met een vroege infectie zijn over het algemeen vatbaarder voor antimicrobiële stoffen, daarom worden deze behandeld met antipseudomonale antibiotica om het ontstaan van chronische infectie tevoorkomen2. Helaas worden niet alle P. aeruginosa-isolaten effectief uit de longen verwijderd na antibioticatherapie. De precieze mechanismen die verband houden met antibioticafalen zijn niet volledig opgehelderd. Eerdere studies hebben aangetoond dat variaties in de dichtheid, aggregatie en productie van polysachariden van biofilmcellen de werkzaamheid van antibiotica kunnen beïnvloeden3. P. aeruginosa produceert drie extracellulaire polysachariden: Pel, Psl en alginaat4. De meeste stammen van P. aeruginosa hebben de genetische capaciteit om elk van de exopolysachariden tot expressie te brengen, hoewel vaak één type polysacharide overwegend tot expressie wordt gebracht5. Het exopolysacharide alginaat wordt in verband gebracht met chronische infecties in de CF-long, wat resulteert in een mucoïde fenotype 6,7. De polysachariden Pel en Psl hebben meerdere functies, waaronder het helpen bij de initiële hechting en het behoud van de biofilmstructuur, en het verlenen van antibioticaresistentie8.
Methoden gericht op het visualiseren van in vivo structuren van weefsels zijn ontwikkeld voor een verscheidenheid aan monstertypes 9,10,11. Meer recentelijk zijn ze op maat gemaakt om in vivo microbiële gemeenschappen in sputum van CF-patiënten te visualiseren12. De optimalisatie van een weefselopruimingsprotocol specifiek voor de identificatie van microbiële gemeenschappen in sputum is ontwikkeld door DePas et al., 201612. De term MiPACT, wat staat voor microbial identification after Passive CLARITY technique, werd bedacht voor het opruimen van CF-sputum11,12. Voor weefselopruimingstechnieken worden de monsters eerst gefixeerd en vervolgens transparant gemaakt, terwijl hun inherente architectuur intact blijft voor kleuring en microscopische visualisatie11. Door CF-sputummonsters te fixeren en op te ruimen, kunnen onderzoekers vragen beantwoorden met betrekking tot biofilmstructuur, bacteriële celdichtheid, polymicrobiële associaties en associaties tussen ziekteverwekkers en gastheercellen. Het voordeel van het direct onderzoeken van bacteriën die in het sputum bewaard zijn gebleven, is dat ze kunnen worden geanalyseerd en gevisualiseerd in een gastheerspecifieke context. Hoewel in vitro groei van klinische isolaten in het laboratorium voor experimenten zeer informatief kan zijn, zijn dergelijke methoden niet in staat om de CF-longomgeving volledig na te bootsen, wat resulteert in een discrepantie tussen laboratoriumresultaten en patiëntresultaten.
De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om sputum te fixeren en te verwijderen om bacteriën te visualiseren, of het nu gaat om CF-patiënten of patiënten met andere luchtweginfecties. Het specifieke type kleuring en microscopische analyse dat hierin wordt beschreven, is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), gevolgd door anti-Psl-antilichaambinding in de hydrogel en daaropvolgende analyse via confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). Na weefselopruiming kunnen ook andere immunohistochemie en microscopiemethoden worden toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is om een glimp op te vangen van de in-situ organisatie van P. aeruginosa-cellen in sputum van CF-patiënten. Sputummonsters moeten bij 4 °C worden bewaard totdat ze worden verwerkt als ze niet onmiddellijk kunnen worden gefixeerd. Het is aangetoond dat het aantal P. aeruginosa-cellen in sputum niet significant verandert als het wordt verwerkt om 1 uur, 24 uur of 48 uur, wanneer het wordt bewaard bij 4 °C, hoewel het aantal bacteriële cellen aanzienlijk zal toenemen als het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de Cystic Fibrosis Foundation bedanken die dit onderzoek financierde en MedImmune voor hun genereuze donatie van anti-Psl0096-antilichamen. Voor deze studie werd beeldvorming uitgevoerd in de CAMiLoD-beeldvormingsfaciliteit van de Universiteit van Toronto.
Materials
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA – GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
