Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

In questo studio, gli esperimenti sono stati progettati per visualizzare la struttura in vivo di Pseudomonas aeruginosa all’interno dell’espettorato di pazienti pediatrici affetti da fibrosi cistica (FC). Le infezioni da P. aeruginosa diventano croniche nel 30-40% della popolazione pediatrica FC; Una volta che le infezioni croniche si sono stabilite, sono quasi impossibili da eliminare¹. Gli isolati di P. aeruginosa provenienti da pazienti con infezione precoce sono generalmente più suscettibili agli antimicrobici, pertanto vengono trattati con antibiotici anti-pseudomonali per prevenire l’instaurarsi di infezioni croniche². Sfortunatamente, non tutti gli isolati di P. aeruginosa vengono eliminati efficacemente dal polmone dopo la terapia antibiotica. I meccanismi precisi associati al fallimento degli antibiotici non sono stati completamente chiariti. Studi precedenti hanno dimostrato che le variazioni nella densità cellulare del biofilm, nell’aggregazione e nella produzione di polisaccaridi possono influenzare l’efficacia degli antibiotici³. P. aeruginosa produce tre polisaccaridi extracellulari: Pel, Psl e alginato⁴. La maggior parte dei ceppi di P. aeruginosa ha la capacità genetica di esprimere ciascuno degli esopolisaccaridi, anche se spesso un tipo di polisaccaride è espresso prevalentemente⁵. L’alginato di esopolisaccaride è associato a infezioni croniche nel polmone FC, con conseguente fenotipo^{mucoide 6,7}. I polisaccaridi Pel e Psl hanno molteplici funzioni, tra cui aiutare l’attacco iniziale e il mantenimento della struttura del biofilm e conferire resistenza agli antibiotici⁸.

Sono stati sviluppati metodi volti a visualizzare in vivo le strutture dei tessuti per una varietà di tipi di campioni 9,10,11. Più recentemente, sono stati adattati per visualizzare le comunità microbiche in vivo all’interno dell’espettorato di pazienti con FC¹². L’ottimizzazione di un protocollo di pulizia tissutale specifico per l’identificazione delle comunità microbiche all’interno dell’espettorato è stata sviluppata da DePas et al., 2016¹². Il termine MiPACT, che sta per identificazione microbiale dopo la tecnica di Passive CLARITY, è stato coniato per la rimozione dell’espettorato FC^11,12. Per le tecniche di purificazione dei tessuti, i campioni vengono prima fissati, quindi resi trasparenti, lasciando intatta la loro architettura intrinseca per la colorazione e la visualizzazione microscopica¹¹. La fissazione e la cancellazione dei campioni di espettorato FC consentono ai ricercatori di rispondere a domande relative alla struttura del biofilm, alla densità delle cellule batteriche, alle associazioni polimicrobiche e alle associazioni tra agenti patogeni e cellule ospiti. Il vantaggio di esaminare direttamente i batteri che sono stati conservati all’interno dell’espettorato è che possono essere analizzati e visualizzati in un contesto specifico dell’ospite. Sebbene la crescita in vitro di isolati clinici in laboratorio per la sperimentazione possa essere molto istruttiva, tali metodi non sono in grado di ricreare completamente l’ambiente polmonare della fibrosi cistica, con conseguente disconnessione tra i risultati di laboratorio e gli esiti dei pazienti.

I metodi qui presentati possono essere utilizzati per fissare e liberare l’espettorato per visualizzare i batteri, sia di pazienti FC che di pazienti con altre infezioni respiratorie. Il tipo specifico di colorazione e analisi microscopica qui descritto è l’ibridazione fluorescente in situ (FISH), seguita dal legame anti-Psl-anticorpo all’interno dell’idrogel e dalla successiva analisi tramite microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Dopo la pulizia dei tessuti, possono essere applicati anche altri metodi di immunoistochimica e microscopia.