Summary

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Published: February 23, 2021
doi:

Summary

Neste artigo de método, apresentamos uma estratégia de triagem de alto rendimento para identificar compostos químicos, como osmolitos, que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.

Abstract

Persisters bacterianos são definidos como uma pequena subpopulação de variantes fenotípicas com a capacidade de tolerar altas concentrações de antibióticos. São uma importante preocupação para a saúde, pois têm sido associadas a infecções crônicas recorrentes. Embora a dinâmica estocástica e determinística dos mecanismos relacionados ao estresse seja conhecida por desempenhar um papel significativo na persistência, os mecanismos subjacentes à mudança fenotípica para/do estado de persistência não são completamente compreendidos. Embora os fatores de persistência desencadeados por sinais ambientais (por exemplo, esgotamento das fontes de carbono, nitrogênio e oxigênio) tenham sido extensivamente estudados, os impactos dos osmólises sobre a persistência ainda estão para ser determinados. Usando microarrays (ou seja, 96 placas de poço contendo vários produtos químicos), projetamos uma abordagem para elucidar os efeitos de vários osmólises na persistência de Escherichia coli de forma de alto rendimento. Essa abordagem é transformadora, pois pode ser prontamente adaptada para outras matrizes de triagem, como painéis de drogas e bibliotecas de genes knockout.

Introduction

Culturas bacterianas contêm uma pequena subpopulação de células persisteras que são temporariamente tolerantes a níveis extraordinariamente altos de antibióticos. As células persisteras são geneticamente idênticas aos seus parentes sensíveis a antibióticos, e sua sobrevivência tem sido atribuída à inibição transitória do crescimento1. Células persisteres foram descobertas pela primeira vez por Gladys Hobby2, mas o termo foi usado pela primeira vez por Joseph Bigger quando ele as identificou nas culturas Staphylococcus pyogenes tratadas com penicilina3. Um estudo seminal publicado por Balaban et al.4 descobriu dois tipos de persistência: variantes tipo I que são formadas principalmente por passagem através da fase estacionária, e variantes tipo II que são geradas continuamente durante o crescimento exponencial. Persisters são detectados por ensaios de sobrevivência clonogênico, nos quais amostras de cultura são colhidas em vários intervalos durante tratamentos com antibióticos, lavadas e banhadas em um meio de crescimento típico para contar as células sobreviventes que podem colonizar na ausência de antibióticos. A existência de persisters em uma cultura celular é avaliada por uma curva de morte bifásica4,5 onde a decadência exponencial inicial indica a morte de células sensíveis a antibióticos. No entanto, a tendência de morte diminui com o tempo, eventualmente levando a uma região platô que representa as células persisteres sobreviventes.

As células persisteres têm sido associadas a várias doenças como tuberculose6,fibrose cística7,candidíase8 e infecções do trato urinário9. Quase todos os microrganismos testados até agora foram encontrados para gerar fenótipos persisteres, incluindo mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Estudos recentes também fornecem evidências do surgimento de mutantes multidroga resistentes a subpopulaçõespersistentes 11,12. Esforços substanciais neste campo revelaram que os mecanismos de persistência são altamente complexos e diversos; tanto fatores estocásticos quanto determinísticos associados à resposta SOS13,14, espécies reativas de oxigênio (ROS)15,sistemas toxina/antitoxina (TA)16,autofagia ou auto-digestão17 e resposta rigorosa relacionada ao PPGPP18 são conhecidos por facilitar a formação de persister.

Apesar dos progressos significativos na compreensão do fenótipo persistência, os efeitos dos osmólises sobre a persistência bacteriana não foram totalmente compreendidos. Uma vez que a manutenção da pressão osmótica ideal é uma necessidade para o crescimento das células, o bom funcionamento e a sobrevivência, um estudo aprofundado dos osmólises poderia levar a potenciais alvos para estratégias anti-persistência. Embora a triagem laboriosa e de alto rendimento seja uma abordagem muito eficaz para identificar metabólitos e outros produtos químicos que desempenham um papel crucial no fenótipo de persistência19,20. Neste trabalho, discutiremos nosso método publicado19, onde usamos microarrays, ou seja, 96 placas de poço contendo vários osmólises (por exemplo, cloreto de sódio, ureia, nitrito de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio), para identificar osmólitos que influenciam significativamente a persistência de E. coli.

Protocol

1. Preparação de estoques médios de crescimento, solução de deloxacina e estoques de células E. coli Meio regular luria-bertani (LB): Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura em água desionizada (DI). Esterilize o meio autoclavando. Placas de ágar LB: Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura e 15 g/L de ágar em água DI e esterilize o meio por autoclavagem. Na temperatura desejada …

Representative Results

A Figura 1 descreve nosso protocolo experimental. Os experimentos do ciclo de diluição/crescimento (ver Protocolo 2) foram adaptados de um estudo conduzido por Keren et al.5 para eliminar os persisters originários das culturas noturnas. Figura 2A é uma imagem representativa das placas de ágar usadas para determinar os níveis de CFU de culturas celulares antes e depois do tratamento OFX. Nesses experimentos, as células foram cultiva…

Discussion

O alto ensaio de persistência de rendimento descrito aqui foi desenvolvido para elucidar os efeitos de vários produtos químicos na persistência de E. coli. Além das placas comerciais da PM, as microarrays podem ser construídas manualmente conforme descrito na etapa 4.2. Além disso, o protocolo aqui apresentado é flexível e pode ser usado para tela de outras microarrays, como painéis de drogas e bibliotecas celulares, que estão em 96 formatos de placas de poço. As condições experimentais, incluindo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Orman por suas valiosas contribuições durante este estudo. Este estudo foi financiado pelo prêmio nih/NIAID K22AI125468 de transição de carreira e uma bolsa de startup da Universidade de Houston.

Materials

14-ml test tube Fisher Scientific 14-959-1B
E. coli strain MG1655 Princeton University Obtained from Brynildsen lab
Flat-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-5161
Gas permeable sealing membrane VWR 102097-058 Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins
Half-area flat-bottom 96-well plate VWR 82050-062
LB agar Fisher Scientific BP1425-2 Molecular genetics grade
Ofloxacin salt VWR 103466-232 HPLC ≥97.5
Phenotype microarray (PM-9 and PM-10) Biolog N/A PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively
Round-bottom 96-well plate USA Scientific 5665-0161
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500 Certified ACS grade
Sodium nitrate Fisher Scientific AC424345000 ACS reagent grade
Sodium nitrite Fisher Scientific AAA186680B 98% purity
Square petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Tryptone Fisher Scientific BP1421-500 Molecular genetics grade
Varioskan lux multi mode microplate reader Thermo Fisher Scientific VLBL00D0 Used for optical density measurement at 600 nm
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-100 Molecular genetics grade

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Cite This Article
Karki, P., Orman, M. A. High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence. J. Vis. Exp. (168), e61597, doi:10.3791/61597 (2021).

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