24時間臓器保存と連続テレメトリを用いた豚モデルにおける異形性腎臓自動移植

本研究は、ARRIVE(動物研究:In Vivo実験の報告)ガイドライン23の原則に従って設計されました。動物の保護に関する制度ガイドラインおよびドイツ連邦法に従って実験を行った。完全な倫理的提案は、責任ある当局によって承認されました(政府動物ケアと使用委員会、LANUV NRW – 「ランデサムト・フュル・ナトゥール、ウムヴェルト・ウント・ヴェルブラウチャーシュッツ・ノルトハイン・ヴェストファーレン」、レックリングハウゼン、ドイツ、プロトコルID:81-02.04.A018.A051)。本研究のすべての動物は、「実験動物のケアと使用のためのガイド」(第8版、NIH出版、2011年、米国)と科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63/EUの原則に従って人道的ケアを受けました(欧州連合の公式ジャーナル、2010)。ドイツの陸上豚は、衛生的に最適化されたバリア繁殖施設(ハインリヒスGbR、ハインスベルク、ノルトハイン・ヴェトファーレン)から得られた。 図1 は、説明した実験プロトコルの概要を示している。 1. 動物と住宅 このプロトコルには、女性のドイツの陸上戦の豚(または同等)を使用してください。動物を順応のために最初の手術(遠隔測定注入)の14日前に研究施設に送り、12時間の明暗サイクルで温度と湿度制御されたバリア環境に収容する(図2)。 部屋の天井に2つのテレメトリレシーバーを取り付け、登録されたデータを観測室にあるPCに直接転送できるようにします。獣医官や担当の動物管理人(8時間ごと、オンデマンド)によって定期的に動物が観察されることを確認してください。注:さらに、この実験では、ローカルネットワークに接続された統合された熱画像を持つリアルタイムカメラ映像が使用されました。この研究で使用される住宅施設の詳細を 図2に示します。 2. 基本的なテクニックと一般的な手順 手術前に動物を一晩速くする。 アザペロン(4mg/kg)とアトロピン(0.1mg/kg)の最初の筋肉内注射によるプレメディケーション、10分後にケタミン(15mg/kg)の注射が続いた。 前投薬後、動物の重量を量り、住宅施設から中央OR施設麻酔準備室に直接移します。 18Gの末梢静脈カテーテルを使用して、大きな耳静脈の1つをカンヌレートします。標準的なECGおよび脈拍のオキシメトリーによって動物を監護しなさい。 プロポフォール(3mg/kg)で麻酔を開始します。 喉頭鏡で声帯を露出させ、7.5mm気管チューブを差し込みます。袖口は製造業者の推薦に従って空気で妨げされる。 胃から液体や空気を除去するために、オロ胃の排液管を挿入します。 尿道を介して尿カテーテルを挿入します。 続いて、外科的切開部の領域で皮膚を整える。 手術中の角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布する。 耳障り管挿管後、イソフルラン(最終呼気1.45-2.0 Vol.%)およびフェンタニル(3 -7.5 μg/kg/h)で麻酔を維持します。 加熱パッドと加温空気を使用して、動物のアクティブな術中温度制御を確保します。直腸プローブを挿入して体温を監視します(目標温度36.5 °C ~37.5°C)。 セフロキシム(35mg/kg i.v.)を使用して抗生物質予防を行う。4 mL/kg/hでリンゲル溶液を注入し、皮膚切開後8mL/kg/hに増加する。耳静脈アクセス上のパントプラゾール(40mg i.v.)の予防用量を投与する。 外科用敗血症および抗敗血症の一般原則に従って、無菌状態下ですべての手術を行う。ポビドネ-ヨウ素溶液で外科分野を消毒し、外科用ドレープで覆う。 3. テレメトリ注入 プロトコルのセクション2に記載の手順に従って手術のために動物を準備し、心拍数の低下と動物の意識的な動きの欠如によって適切な麻酔を確認します。 血液および尿サンプルを収集して、個々のベースラインラボ値を決定します。 永久的なマーカーを使用して切開部位をマークします。 テレメトリトランスポンダの動脈センサを移植するために、鼠径部に3〜4cmの切開を行う。360°の方法で動脈を露出し、解剖する。 オーバーホルトクランプを使用して、動脈の下の2つの容器ループを引っ張り、蚊クランプでそれらを固定します。 ブレードメスを使って動脈#11開いた後、動脈センサーを挿入します。単一結び目縫合糸を用いて5-0ポリプロピレン縫合糸を使用して動脈開管を閉じ、これらの縫合線の1つを使用して動脈センサーを固定します。 動物の左脇腹に3〜4cmの大切開を行い、鈍い解剖によってトランスポンダーのための皮下ポーチを作成します。 テレメトリ トランスポンダを側面にトンネルし、筋筋膜(3-0 ポリプロピレン、単一結び目)に固定します。赤と白のECG電極を胸郭の左右にトンネルします。2つの1cm切開を行い、筋肉組織の電極を固定して、単一結び目縫合(3-0ポリグラクチン)で良好なECG信号を確保します。 テレメトリデータの登録を開始し、様々な信号(例えば、トランスポンダ本体自体によって登録された体温、動脈血圧、心電図信号)を確認します。 鼠径部の切開を閉じ、左脇腹と筋肉と皮下縫合糸(3-0ポリグラクチン)を使用して2つの小さな経嚢切開を閉じ、非吸収性モノフィラメント縫合(例えば、2-0プロレン)を使用して皮膚を閉じる。 スプレーフィルムドレッシングを使用して、切開部位を密封します。 この時点で、動物が研究期間の残りの部分のために着用する指定されたブタジャケットを着用するように動物を準備します。すべての外科的介入に続いて、ジャケットを清潔なジャケットに置き換えます。注: 安定したベースラインデータを記録するために、インデックス手術の14日前にテレメトリトランスポンダが移植されます(左腎摘出術、 ディスカッションも参照してください)。 4. 腎摘出と腎臓移植片の検索 セクション2に記載の手順に従って、移植片検索手術のために動物を準備する。 麻酔の誘導後、外部頸静脈をカニューレ化する。外科分野の無菌消毒に続いて、頸部溝の右側に4cmの切開がなされる。 皮下組織および筋肉を解剖し、外的頸静脈を露出させる。 360°の方法で静脈を露出し、解剖する。 オーバーホルトクランプを使用して、静脈の下の2つの容器ループを引っ張り、蚊のクランプでそれらを固定します。 動物の後ろに頸部カテーテルをトンネルします。このためには、豚を左側に置きます。セルディンガー法を使用して、頸部カテーテルを挿入します。 静脈の開口部を閉じ、5-0ポリプロピレン縫合糸を使用してカテーテルを固定します。 2層で切開を閉じます(例えば、3-0ポリグラクチンは筋肉と皮下、皮膚用のポリプロピレンは2-0)。 複数の縫合線(2-0ポリプロピレン)でカテーテルを皮膚に固定します。 自由な吸引および注入のための頸静脈カテーテルをテストする。続いて、静脈から中央静脈線に静脈内線を切り替える。 外科的消毒およびドレープの後、腹部(25〜30cm)を開くために中腹開術を行う。標準的な腹部リトラクタを使用して外科分野を露出する。 結腸と小腸を覆うために濡れた暖かい腹部タオルを使用してください。腎臓とその血管構造を暴露する右半腹部の方向に腸を保持するために2番目のアシスタントに依頼. 腹膜層を開き、単極性の焼灼、双極鉗子、および細かいはさみを使用して、任意の付着組織から左腎臓と尿管を解剖する。 リゲートと左尿管(3-0ポリグラクチン)を分け、少なくとも10〜12cmの長いセグメントを残す。 左腎静脈の解剖と下の大動脈からその起源に動脈をそれぞれ完了します。注:この解剖学的領域での大きなリンパ管の損傷や開口部を避けてください。また、アチゴ腰椎静脈が静脈からその起源に近い腎静脈に結合する潜在的な傷害に注意してください。 2つの合字(3-0ポリグラクチン)の間のアチゴ腰椎静脈を解剖し、リゲートする。 氷のボウルと滅菌カバーを使用して、バックテーブル解剖の準備をします。 移植片腎臓を取り出すために、腎動脈と腎静脈を大動脈と静脈の近くに血管クランプで固定します。クランプの近くのはさみで血管を切断して腎臓移植片を取り除き、腎臓を後方テーブルチームに引き渡します。 5-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、腎動脈の切り株を閉じます。5-0ポリプロピレンを用いた2層連続縫合糸を使用して腎静脈を閉じます。血管クランプを取り外します。 出血やリンパ漏れの領域を確認した後、4層の腹部を閉じます。注:腹腎:3-0ポリグラクチンランニング縫合線;筋膜: 0 ポリグラクチンランニング縫合;皮下層: 3-0 ポリグラクチンの流れ縫合;皮膚:腎臓検索手術後の皮膚ステープラーは、翌日に腹部を再開けしやすくし、2-0ポリプロピレン単結糸縫合糸を移植後に決定的な閉鎖を促進する。 無菌創傷包帯を塗布した後、動物を住宅施設に戻し、気管内挿管後に回復することを許可する。術後鎮痛の場合は、ブプレノルフィン(0.05-0.1mg/kg)を筋肉内8時間ごとに使用して、自動移植を行う。 5. バックテーブルと臓器保存 移植片の検索後、標準14G(オレンジ)の末梢カテーテルを用いて直ちに腎動脈をカニュール化し、3-0ポリグラクチンから調製した止血帯を用いて固定する。 腎臓を冷たい臓器保存液ですすます。 500 mLの臓器保存液で洗い流した後、動脈カニューレを取り出し、無菌臓器袋に腎臓移植片を包み込み、コンピュータ制御冷却回路を使用して4°Cで24時間の目標冷間虚血時間(CIT)で臓器保存液に保存します。注:4°Cの通常の生理液溶液の500 mLを使用して、簡単な保存後のフラッシュをお勧めします。 6. 逆側腎摘出術と整形性腎自動移植 受取者の手術中に、制限された腎代謝に前投薬と初期麻酔を適応させ、ケタミンの使用を避ける。誘導はプロポフォール(3-5 mg/kg i.v.)、ミダゾラム(0,25mg/kg i.v.)、およびアトロピン(0.1mg/kg i.m)で行われる。その後、術前準備はセクション2で説明した手順と同一である。 イソフルラン(最終呼気1.45-2.0 Vol.%)およびフェンタニル(3 – 7,5 μg/kg/h)およびプロポフォール(2 – 4 mg/kg/h)で麻酔を維持します。 ECG、パルスオキシメトリー、直腸温度、およびテレメトリトランスポンダの機能を確認し、継続的に監視します。注:厳密な麻酔と血圧制御は、移植手順の間に非常に重要です。 テレメトリトランスポンダ上に登録された動脈血圧信号が動物の圧入り位置に起因して満足のいくものではない稀な場合には、経皮穿刺法とセルディンガー技術を用いてさらに動脈カテーテルを右大腿動脈に入れる。 無菌ドレープの後、中央開腹性開腹術を再開し、腹部リトラクタを使用して外科フィールドを露出させる。結腸と小腸は腹部の左側に置かれ、無傷の右腎臓を露出する。 ドナー処置と同様に、周囲の組織から対側腎臓とその血管を解剖する。右腎静脈と腎動脈を腎結膜の方向に解剖し、吻合に十分な血管長を確保する。 血管クランプの5分前に、ナトリウムヘパリンを静脈内に注入する(100 I.U./kg)。 血管クランプを使用して右腎動脈と右腎静脈をクランプします。右の腎臓は取り除かれる。血管は、アナストモーゼを開始する前に完全性をチェックされます。 保存された移植片腎臓を腹部に入れ、静脈および動脈のアナストモーセを開始する。 この時点以降、平均動脈圧を80~90mmHg以上に保ち、再灌流後の腎臓移植片の良好な早期灌流を確保する。これを部分的に適切な容積管理とノルエピネフリンの投与によって部分的に達成する(0.1 – 1.0 μg/kg/minは、平均動脈血圧と心拍数を使用して効率を監視するための継続的な注入として)。 腎静脈のエンドツーエンド吻当を行う: 5-0ポリプロピレンを使用して2つのコーナーステッチを配置した後、連続的な方法で背面壁を縫合します。 頭蓋のコーナーステッチを結び、後壁に使用する糸と一緒に結びます。 後ろの壁を終えたら、頭蓋コーナーステッチを使用して、頭蓋-尾状方向に前壁を縫合します。アヘパリン化した生理食水溶液(100 I.U./mL)で静脈を洗い流します。コーダルコーナーステッチを結びます。注:ドナー側と受取人側の間にサイズの不一致がある場合、小さな成長因子を使用して、広く十分な吻合を確実にすることができます。豚の腎静脈の枝の多くの可能なバリエーションがあります。.複雑な静脈解剖学の場合、改変された解剖学のアプローチが必要である( 図3を参照)。 腎動脈のエンドツーエンド吻当を行う: 動脈吻合を行うために6-0ポリプロピレン頭蓋コーナーステッチを使用してください。後で取り除かれるコーナーステッチを支持するさらにカウダルを配置することは任意です。 パラシュート技術を使用して連続的に後壁を縫合します。コーダルコーナーに到着した後、2番目のコーナーステッチを取り外します(該当する場合)。 二重武装6-0ポリプロピレン縫合の反対側で前面壁を縫合します。ヘパリン化した生理的な溶液(100 I.U./mL)で動脈を洗い流す。コーダルコーナーで2本の糸を結びます。 両方のアナストモーゼを実行するために必要な時間を<40分の目標暖かい虚血時間で記録します。 静脈血管クランプを開き、続いて動脈クランプを開くことによって腎臓を再浸透する。著しい出血がないか確認してください。 もし、アナストモーゼから有意な出血が見られない場合、腎臓移植片を解き放ち、再移植片を覆う腹部に温かい正常な生理液を注ぐ。 必要に応じて移植片を再配置して、均質な再灌流を確保し、輻輳を回避します。 パパベリンを腎動脈の外側および動脈吻合(5 mL未希釈)の外側に局所的に投与する。 再灌流後、20%グルコース溶液の250mLを注入し、浸透性のジエレシスを誘導し、続いて80mgのフロセミドを単回投与した。注:これに続いて、最初の尿の生産が観察されるかもしれません。 尿の排液を確実にするために、動物の右側面の腹壁を通って12フランスの小児尿カテーテルを後腹膜に通す。 合字(2-0ポリグラクチン)を使用して尿管内のカテーテルを固定し、2 mL生理液でカテーテルをブロックします。さらに縫合糸は、腹壁(2-0ポリプロピレン)の腹膜に尿管を適応させ、固定するために使用される。カテーテルはまた、少なくとも2つの単一結び目縫合糸(2-0ポリプロピレン)で皮膚に固定されています。 腎臓移植片の転位と血管性アナストモーゼ(3-0ポリグラクチン)のキンキングを防ぐために、腎臓の上に腹膜層を閉じます。 移植片の検索のために先に述べたように同様の4層の方法で腹部を閉じます。 腹部閉鎖後、ORテーブルのノルマニアを維持する。注:平均動脈血圧は、動物が目を覚まし、起こりやすい位置になるまで80mm Hg以上維持する必要があります。 腹部閉鎖後、色ドップラー超音波を使用して、腎臓移植片の十分な動脈および静脈灌流を確保する(図4)。動物が完全に目を覚まし、自発的に歩いたり飲んだりできるまで、動物を注意深く監視してください。動物は、回収段階でリンゲル溶液の1Lを与えられる。 その後、動物を住宅施設の箱に戻します。 7. フォローアップ、サンプル、データ収集 彼らは自発的に飲むことができるとすぐに動物に水アドリビタムを提供します。術後1日目から固形食品を提供する。 術後鎮痛の場合、ブプレノルフィン(0.05-0.1mg/kg)を72時間8時間毎に筋肉内投与し、パントゾール(40mg i.v.)を1日1回72時間投与する。抗生物質治療(セフロキシム35mg/kg i.v.毎日2倍)および血栓症予防(術後1日目から500mgのアセチルサリチル酸)を全観察期間の間に提供する。注:出血合併症が発生した場合、アスピリンは中止されます。 観測期間全体を通して連続したテレメトリ データを登録します。動物が獣医官および/または経験豊富な獣医技術者によって少なくとも8時間ごとに訪問されることを確認し、その臨床状態は、動物の臨床状態によって必要とされる場合に実験を早期に終了するための基礎として使用されるスコアシートを使用して評価されます。注: これらのいわゆる人道的エンドポイント基準は、前に説明した24のように定義されています。 中央静脈線と経皮尿カテーテルを使用して毎日サンプル収集を行います。尿袋(2,000 mL)を毎日2倍に変更します。 サンプル採取または液体または薬物の投与に続いて、閉塞を避け、新しい滅菌キャップでそれをカバーするために、すべての使用の間にヘパリン化生理食い溶液(100 I.U./mL)を用いて中央静脈カテーテルをブロックします。 5〜7日の対応する観察期間に続いて、腎臓移植片の再ラパロトミー、サンプル採取および排泄後の深部麻酔で動物を犠牲にする。犠牲はペントバルビタールの単一の注入を使用して行われる(50 – 60 mg /kg i.v.)。注:3R原則に従って、犠牲動物の残りの器官および組織は、社内機関で様々なex vivo研究と教育目的のために使用することができる。