デンプン顆粒サイズ分布の解析と仕様
Summary
ここでは、デンプン顆粒サイズ分布の再現性と統計的に有効な決定、および2パラメータ乗法形式を使用して決定された顆粒対数正規サイズ分布を指定するための手順を示します。植物や食品科学の研究のためのグラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能です。
Abstract
すべての植物源からの澱粉は、異なる発生頻度を有する様々なサイズおよび形状の顆粒で構成されている、すなわち、サイズおよび形状分布を示す。 いくつかのタイプの粒子サイズ設定技術を用いて決定されたデンプン顆粒サイズデータは、顆粒形状への感受性や顆粒サンプルサイズの制限など、乗り越えられない体系的な誤りから生じる再現性の悪さや統計的有意性の欠如のためにしばしば問題となる。電気センシングゾーン手法を用いてデンプン顆粒サイズ分布の再現性と統計的に有効な決定、精度と比較可能性を向上させた採用された2パラメータ乗算形式を用いて決定された顆粒対数サイズ分布を指定する手順を概説した。これは、グラムスケールデンプンサンプルのすべての顆粒サイジング分析に適用可能であり、したがって、デンプン顆粒サイズがデンプン生合成装置およびメカニズムによってどのように成形されているかに関する研究を容易にする可能性があります。そして、それらが食品および産業用途のためのデンプンの特性および機能性に与える影響。代表的な結果は、概説された手順を用いて、サツマイモの澱粉サンプルの顆粒サイズ分布の複製分析から提示される。我々はさらに、手順のいくつかの重要な技術的側面、特に、顆粒対数正規サイズ分布の乗算仕様と、顆粒凝集体による頻繁な開口閉塞を克服するためのいくつかの技術的手段について議論した。
Introduction
デンプン顆粒は、植物光合成および貯蔵組織における2つの主な予備ホモグルカンポリマー、線形またはまばら分岐アミロースおよび高度に分岐したアミロペクチンが、脂質およびタンパク質を含むいくつかのマイナーな成分と一緒に整然と詰まっている物理的構造である。さまざまな植物種のデンプン顆粒は、球体、楕円体、多面体、血小板、立方体、立方体、不規則な細管を含む多くの3次元(3D)形状(ref.1、2)を示す。同じ組織や同じ植物種の異なる組織のそれらでさえ、様々な発生頻度を持つ形状のセットを持つことができます。つまり、植物種由来のデンプン顆粒は、特定の形状ではなく、特徴的な統計的形状分布を有し得る。不均一で球状の顆粒形状により、デンプン顆粒のサイズを適切に測定および定義することが困難になります。さらに、植物種の同じ組織由来のデンプン顆粒は、異なる割合のサイズの範囲、すなわち、特徴的なサイズ分布を示す。このサイズ分布は、デンプン顆粒サイズの分析と記述をさらに複雑にします。
デンプン顆粒のサイズは、顕微鏡、沈積/立体式場流分画(Sd/StFFF)、レーザー回折、電気センシングゾーン(ESZ)を含む粒子サイズ化技術のいくつかのカテゴリ(ref.3)を使用して分析されています。しかしながら、これらの技術は、顆粒状およびサイズ分布の存在下でのデンプン顆粒サイズの決定に等しく適していない。光、共焦点、走査型電子顕微鏡を含む顕微鏡は、形態4、5、6、7、構造8、9、およびデンプン顆粒の開発10、11の研究に優れていますが、固有の欠点のためにそのサイズ分布を定義するのにはほとんど適していません。いくつかの種のデンプンの顆粒サイズの決定に使用されてきた光学顕微鏡データ(IAOM)の顕微鏡顆粒画像またはソフトウェア支援画像分析の直接測定、 トウモロコシ12、小麦13、14、ジャガイモ15、大麦16を含む、1D(通常は最大長)または2D(表面積)サイズの非常に限られた数(数万から数千)のデンプン顆粒画像のみを測定することができます。技術によって本質的に制約される小さな顆粒サンプリングサイズは、デンプンの単位重量当たりの巨大な顆粒数(1グラム当たり120 x 10 6、1.5 g/cm³密度で10 μmの球すべてを仮定)を考慮すると、統計的に代表されることはほとんどありません。Sd/StFFF技術は、高速および分解能、およびデンプン顆粒17の狭いサイズの画分を有する可能性があるが、その精度は、損傷、異なる形状、およびデンプン顆粒の密度によって深刻な影響を受ける可能性があるため、おそらくほとんど使用されていない。レーザー回折技術は最も広く使用され、すべての主要な作物種3、14、16のデンプン顆粒サイズ分析に適用されています。この技術には多くの利点があるが、実際には顆粒形状分布の存在下でのデンプン顆粒サイズの決定には適していない。同時レーザー回折器のほとんどは、均一な球状粒子の三重光散乱理論18と、他の均一性の形状については修正されたMie理論18に依存している。この技術は、したがって、本質的に粒子形状に非常に敏感であり、均一性19の特定の形状にも完全には適しておらず、ましてや様々な割合の形状のセットを有するデンプン顆粒に対しては完全に適していない。ESZ技術は、開口を通過する粒子の体積に比例する電界の乱れを測定する。粒状の体積サイズ、数、体積分布情報などを高解像度で提供します。ESZ技術は、色、形状、組成または屈折率を含む粒子の光学特性とは無関係であり、結果は非常に再現性が高いため、特に一連の形状を有するデンプン顆粒のサイズ分布を決定するのに適している。
デンプン顆粒のサイズも多くのパラメータを使用して定義されています。それらはしばしば平均直径によって皮口的に記述されたが、これはいくつかのケースでは、2D画像12、20、または同等の球径の平均の顕微鏡的に測定された最大長の算術手段であった3。他の場合には、粒状サイズ分布は、サイズ範囲21、22、分布平均容積または平均直径(球量、数、体積、または表面積で重み付け)を使用して指定した場合は、正規分布14、23、24、25、26である。様々な分析からデンプン顆粒サイズのこれらの記述子は、非常に異なる性質のものであり、厳密に比較することはできません。異なる種のデンプン顆粒のこれらの「大きさ」、あるいは同じ種の同じ組織を直接比較した場合、それは非常に誤解を招く可能性があります。さらに、想定された正規分布の広がり(または形状)パラメータ、すなわち、分布の幅(すなわち、サイズの広がり)を測定するσ標準偏差(またはグラフィック標準偏差σ g)は、ほとんどの研究で無視されている。
デンプン顆粒のサイジング分析が直面している前述の重大な問題を解決するために、ESZ技術を用いてデンプンサンプルの顆粒サイズ分布を再現可能かつ統計的に有効な決定を行う手順と、採用された2パラメータの対数正規サイズ分布を正確かつ可分性の向上を用いて適切に指定する手順を概説した。検証とデモンストレーションのために、サツマイモ澱粉サンプルの複製顆粒サイズ分析を手順を用いて実行し 
、x/(乗算および除算)s* 形式で、そのグラフィック幾何平均と乗算標準偏差s * を使用して対数微分体積率体積等価球径分布を指定しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
概説された手順は、デンプン顆粒サイズ分析のためのいくつかの既存の方法でいくつかの重要な問題を解決しました, 3D顆粒の不適切な1Dまたは2Dサイジング、均一な顆粒形状によるサイズ測定の歪み、限られた顆粒サンプルサイズによる再現性の悪さ、疑わしい統計的妥当性、顆粒形状と無正規サイズ分布の両方の存在下での顆粒サイズの不正確または不適切な仕様(特に平均サイズの使用)を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、農業大学総合農業研究センターと農業・人間科学部総合食料安全保障研究センター、プレーリービューA&M大学によって支えられている。私たちは、彼の技術サポートのために華天に感謝します。
Materials
| Analytical beaker | Beckman Coulter Life Sciences | A35595 | Smart-Technology (ST) beaker |
| Aperture tube, 100 µm | Beckman Coulter Life Sciences | A36394 | For the MS4E, , 1000 µm |
| Disposable transfer pipettor, | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 13-711-9AM | Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used. |
| Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 05-539-13 | Any other similar types of tubes can be used. |
| Glass beakers, 150 to 250 ml | Fisher Scientific (Fishersci.com) | 02-540K | These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs. |
| LiCl | Fisher Chemical | L121-100 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A412-500 | Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol. |
| Mettler Toledo ML-T Precision Balances | Mettler Toledo | 30243412 | Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work. |
| Multisizer 4e Coulter Counter | Beckman Coulter Life Sciences | B23005 | The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company. |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher Ultrasound Technology | UP50H | Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension. |
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