유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정
Summary
이 프로토콜의 전반적인 목표는 Plasmodium falciparum 감염에 자연적으로 드러나는 개인의 혈장 또는 혈장에 존재하는 항체의 용량을 측정하는 방법에 대한 지침을 제공하여 기생충에 감염된 적혈구 (IEs)의 phagocytosis를 opsonize 및 유도하는 것입니다.
Abstract
이 프로토콜은 VAR2CSA에 특이적으로 획득한 IgG 항체에 의해 불투명화된 플라스모듐 팔시파룸-감염된적혈구(IEs)의 유동 세포측정 기반 phagocytosis 분석법을 설정하고 실행하는 방법을 설명합니다. VAR2CSA는 태반 말라리아 (PM)라고 불리는 임산부에서 심각한 형태의 말라리아를 일으킬 수있는 태반에서 IEs의 선택적 격리를 매개하는 기생충 항원입니다. PM으로부터의 보호는 태반 격리를 억제하고/또는 phagocytosis에 대한 IEs를 오손화하여 기능하는 것으로 여겨지는 VAR2CSA 특이적 항체에 의해 매개됩니다. 분석은 VAR2CSA, 자연스럽게 획득된 PM 특이적 면역을 가진 여성의 플라즈마/혈청 항체, 그리고 식세포주 THP-1을 발현하기 위해 시험관에서 선택된 후기 단계 동기화 IE를 채용한다. 그러나, 프로토콜은 자연 노출에 의해 유도되거나 예방 접종에 의해 유도되든 IE 표면에 존재하는 모든 기생충 항원에게 항체의 기능을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 분석은 말라리아에서 항체 매개 면역의 중요한 기능적 측면의 좋은 재현성을 가진 간단하고 높은 처리량 평가를 제공합니다. 따라서, P. falciparum 말라리아에 임상 면역을 평가할 때 유용, 열대에서 이환율과 사망의 주요 원인, 특히 사하라 사막 이남의 아프리카에서.
Introduction
말라리아는 플라스모듐속의 5개의 다른 종을 가진 감염시 인간에서 생기는 벡터 매개 질병입니다. 가장 널리 퍼진 종은 P. falciparum,또한 가장 이환율과 사망률에 대 한 책임은1. 말라리아 임상 프리젠 테이션은 무증상 또는 양성 감염에서 복잡 / 심한 질병에 이르기까지 다양하며, 후자는 5 세 미만의 어린이에서 주로 발생합니다. P. falciparum에 노출은 멸균 면역을 유도하지 않습니다, 그러나 풍토성 지역에 사는 개별은 천천히 임상 질병에 대하여 면역을 개발합니다. 보호는 나이/노출에 따라 다르며 면역은 일반적으로 생활의 첫번째 5-10 년 도중취득됩니다 2. 성인 여성은 태반 말라리아 (PM)로 알려진 임상 프리젠 테이션에서 임신 중에 심각한 말라리아가 발생할 수 있기 때문에 중요한 예외입니다. PM은 낙태, 사산, 조산, 저출산, 태아 사망 및 모계 빈혈의 중요한 원인입니다. PM에 대한 저항은 연속 임신3을통해 개발됩니다. PM으로부터의 보호는 VAR2CSA 형 PfEMP14,5,5콘드로이틴 황산염 A(CSA)에 결합하는 감염된 적혈구(IE) 표면 항원에 대한 항체의 획득과 관련이 있어 태반에서 IE 격리를 가능하게 한다. 항체 중재 보호는 phagocytosis를 유도하기 위하여 IEs의 편화를 포함하여 각종 기능적 활동(6,,7에서검토)를 능력을 발휘합니다. 초기 시험관내 연구는 항체가 phagocytosis 를 통해 단핵구의 존재에 있는 P. falciparum 성장을 제한할 수 있다는 것을 보여주었다8,,9. 최근 연구에 따르면 식세포증유도 항체의 높은 수준은 더 나은 임신 결과(HIV 공동 감염의 맥락에서)10,,11로자연적으로 획득된 면역 반응에서 이 이펙터 기능의 관련성을 나타내는 것으로 나타났습니다.
여기서 우리는 단핵선 THP-1과 함께 VAR2CSA를 발현하는 체외 배양 IE를 사용하여 인간 플라즈마/혈청에 존재하는 항체의 이 기능을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 분석법은,이전에11, 12,,1214,13,15,,15,16,17,,18을 사용했으며, 항체의 작은 볼륨을 사용하여 한 번의 실행에서 더 많은 수의 항체 시료를 테스트하고 지루하고 편향된 현미경 검사세계산을 피할 수 있기 때문에 이전 현미경 기반 프로토콜8에비해 개선되고 쉬운 접근법으로 간주됩니다. 분석이 여러 실험실에서 사용되었으며 실행은 충분히 간단하지만 신중한 계획과 준비가 필요하므로 상세한 프로토콜은 이전 경험이 부족한 실험실 및 연구자들에 의한 응용 프로그램을 허용합니다. 우리는, 예를 들어, VAR2CSA를 발현하는 말기 동기화 IEs를 사용하여 자연스럽게 PM 특이적 면역을 획득한 여성으로부터 수집된 혈청에 존재하는 항체로 오손화됩니다. 그러나, 프로토콜은 자연 노출에 의해 유도되거나 예방 접종에 의해 유도되든 IE 표면에 존재하는 모든 기생충 항원에게 항체의 기능을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 제시된 프로토콜은 이전에 기술및 THP-1 세포에 의한 편화 및 식세포증을 유도하기 위해 P. falciparum IEs의 표면을 표적으로 하는 항체의 용량을 측정하기 위하여12,,15,,17,,31을 이용하였다. 여기에 제시 된 결과는 P. falciparum 풍토성 지역에 사는 여성의 플라즈마 / 혈청에서 VAR2CSA 특정 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마이켄 비스티는 우수한 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 덴마크 외교부로부터 보조금(MAVARECA II; 17-02-KU)에 의해 지원되었으며 다니다 펠로우십 센터가 관리했습니다. 펀더는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
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