Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test
Summary
Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.
Abstract
Het protocol beschrijft hoe een op stroom gebaseerde phagocytosetest van Plasmodium falciparum-geïnfecteerdeerytrocyten (IEs) op te zetten en uit te voeren, opmeting door natuurlijk verworven IgG-antilichamen die specifiek zijn voor VAR2CSA. VAR2CSA is het parasietantgeen dat bemiddelt bij de selectieve inbeslagname van IE’s in de placenta die een ernstige vorm van malaria kan veroorzaken bij zwangere vrouwen, placentamalaria (PM). Bescherming tegen PM wordt bemiddeld door VAR2CSA-specifieke antilichamen die vermoedelijk functioneren door het remmen van placenta-inname en/of door het opsoniseren van IE’s voor fagocytose. De test maakt gebruik van laat-stadium-gesynchroniseerde IEs die zijn geselecteerd in vitro om VAR2CSA, plasma / serum-antilichamen uit te drukken van vrouwen met natuurlijk verworven PM-specifieke immuniteit, en de fagocytische cel lijn THP-1. Het protocol kan echter eenvoudig worden gewijzigd om de functionaliteit van antilichamen tegen parasietantigeen op het IE-oppervlak te testen, hetzij veroorzaakt door natuurlijke blootstelling of door vaccinatie. De test biedt eenvoudige en hoge doorvoer evaluatie, met een goede reproduceerbaarheid, van een belangrijk functioneel aspect van antilichaam-gemedieerde immuniteit in malaria. Het is daarom nuttig bij de evaluatie van de klinische immuniteit tegen P. falciparum malaria, een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de tropen, met name in Afrika bezuiden de Sahara.
Introduction
Malaria is een door vector overgedragen ziekte die bij de mens wordt veroorzaakt bij infectie met vijf verschillende soorten van het geslacht Plasmodium. De meest voorkomende soort is P. falciparum, dat ook verantwoordelijk is voor de meest morbiditeit en mortaliteit1. Malaria klinische presentatie varieert van asymptomatische of goedaardige infecties tot gecompliceerde / ernstige ziekte, de laatste komt meestal voor bij kinderen jonger dan vijf jaar. Blootstelling aan P. falciparum leidt niet tot steriele immuniteit, maar personen die in endemische gebieden leven, ontwikkelen langzaam immuniteit tegen de klinische ziekte. Bescherming is afhankelijk van leeftijd/blootstelling en de immuniteit wordt normaal gesproken verworven tijdens de eerste 5-10 jaar van het leven2. Volwassen vrouwen zijn een belangrijke uitzondering, omdat ernstige malaria kan optreden tijdens de zwangerschap in een klinische presentatie bekend als placentamalaria (PM). PM is een belangrijke oorzaak van abortus, doodgeboorte, vroegtijdige bevalling, laag geboortegewicht, foetale dood, en moederbloedarmoede. Weerstand tegen PM ontwikkelt zich over opeenvolgende zwangerschappen3. Bescherming tegen PM wordt geassocieerd met de verwerving van antilichamen tegen VAR2CSA-type PfEMP14,5, een besmet erythrocyte (IE) oppervlakteantigenen dat zich bindt aan chondroitin sulfaat A (CSA) waardoor IE-sekwestratie in de placenta mogelijk wordt. Antilichamen bemiddelen bescherming bij het uitvoeren van verschillende functionele activiteiten (beoordeeld in6,7) waaronder opsonisatie van IEs om fagocytose te induceren. Vroege in vitro studies toonden aan dat antilichamen de groei van P. falciparum kunnen beperken in aanwezigheid van monocyten via fagocytose8,9. Recentere studies hebben aangetoond dat hogere niveaus van fagocytose-inducerende antilichamen worden geassocieerd met betere zwangerschapsresultaten (in de context van HIV-co-infectie)10,11, wat de relevantie van deze effectorfunctie in de natuurlijk verworven immuunrespons aangeeft.
Hier presenteren we een protocol om deze functie van antilichamen aanwezig in menselijk plasma / serum te meten, met behulp van in vitro gekweekte IT’s uitdrukken VAR2CSA samen met de monocyten lijn THP-1. De test is eerder gebruikt11,12,13,14,15,16,17,18 en wordt beschouwd als een verbeterde en gemakkelijkere aanpak in vergelijking met eerdere microscopie gebaseerde protocollen8, omdat het mogelijk maakt het testen van een groter aantal antilichaam monsters in een enkele run met behulp van kleinere volumes van antilichamen en het vermijden van vervelende en bevooroordeelde microscopie tellen. Hoewel de test is gebruikt door meerdere laboratoria en de uitvoering ervan is eenvoudig genoeg, het vereist een zorgvuldige planning en voorbereiding, daarom, een gedetailleerd protocol zou de toepassing ervan door laboratoria en onderzoekers ontbreekt eerdere ervaring. We gebruiken als voorbeeld laat-stadium-gesynchroniseerde IEs uitdrukken VAR2CSA opsonized met antilichamen aanwezig in serum verzameld van vrouwen met natuurlijk verworven PM-specifieke immuniteit. Het protocol kan echter eenvoudig worden gewijzigd om de functionaliteit van antilichamen tegen parasietantigeen op het IE-oppervlak te testen, hetzij veroorzaakt door natuurlijke blootstelling of door vaccinatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is eerder beschreven en gebruikt12,15,17,31 om de capaciteit van antilichamen te meten die gericht zijn op het oppervlak van P. falciparum-II’s om opsonisatie en fagocytose te induceren door THP-1-cellen. De hier gepresenteerde resultaten richten zich op natuurlijk verworven VAR2CSA-specifieke antilichamen in het plasma/serum van vrouwen die in een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti wordt bedankt voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd deels gefinancierd door een subsidie (MAVARECA II; 17-02-KU) van het Ministerie van Buitenlandse Zaken van Denemarken en beheerd door Danida Fellowship Centre. De financier had geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
