JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Published: August 06, 2020
doi:
10.3791/61525
, , , , , , , , , ,
1Genome Biology of Neurodegenerative Diseases,German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Applied Genomics for Neurodegenerative Diseases,German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 3Department for Neurodegenerative Diseases, Hertie Institute for Clinical Brain Research,University of Tübingen

Summary

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürlerinin otomasyonu ve otomatik görüntüleme ve analiz ile uyumlu nöronal farklılasyonlar gösteriyoruz.

Abstract

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC) manuel kültür ve farklılaşma protokolleri standartlaştırmak, yüksek değişkenlik göstermek ve istenmeyen hücre tiplerine spontan farklılaşmayatkındır. Yöntemler emek yoğundur ve büyük ölçekli deneylere kolayca uygun değildir. Bu sınırlamaları aşmak için, yüksek iş letimatif görüntüleme sistemiyle birleşen otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik ve paralel ve nöronal farklılaşmada birden fazla hiPSC hattını korumak için protokoller uyguladık. 6\u20128 gün içinde hiPSC kaynaklı kortikal nöronlar üretmek için Neurogenin-2 (NGN2) aşırı ekspresyonu kullanarak kısa süreli bir farklılaşma protokolünün otomasyonunu ve 65 gün içinde hiPSC kaynaklı orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronları üretmek için uzun vadeli bir ayırım protokolünün uygulanmasını tanımladık. Ayrıca, GFP lentivirus ile transekküçük bir molekül türevi nöral öncül hücrelere (smNPC) NGN2 yaklaşımını uyguladık ve canlı hücre otomatik neurite outgrowth testi oluşturduk. Rutin hiPSC kültürüne ve kortikal ve dopaminerjik nöronlara farklılaşmaya uygun protokollere sahip otomatik bir sistem salıyoruz. Platformumuz, yeni hastalık mekanizmalarını ve ilaç hedeflerini belirlemek için uzun vadeli eller serbest kültür ve yüksek içerikli/yüksek içerikli hiPSC tabanlı bileşik, RNAi ve CRISPR/Cas9 gösterimleri için uygundur.

Introduction

İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC) kendi kendini yenileyen ve hemen hemen her yetişkin hücre tipinde ayırt edebilirsiniz. Bu özellikler hiPSC temel araştırma ve ilaç keşif1hastalık modelleme için yararlı bir araç olun. İnsan iPSC en çok etkilenen / hastalık ders dahil hastalık ile ilgili hücre tipleri türetilmesi sağlayan donör genetik arka plan korur, örneğin, nörodejeneratif hastalıklar için farklı nöronal alt tipleri2,3. Ayrıca, hiPSC bir insan bağlamında ve fizyolojik protein ekspresyonu düzeyleri hastalıkları modelleyerek hayvan ve hücresel aşırı ekspresyon modellerinin bazı sınırlamalar üstesinden gelir ve monojenik arasında değişen hastalıkların modelleme değerli bir varlık olduğu kanıtlanmıştır, karmaşık ve epigenetik bozukluklar yanı sıra geç başlangıçlı hastalıklar4.

Bu avantajlara ve fırsatlara rağmen, hiPSC’nin çeşitli sınırlamalarının hala ele alınması gerekmektedir. Mevcut hiPSC kültürü ve farklılaşma protokolleri uygun maliyetli değildir, standartlaştırılması zordur ve emek yoğundur. Manuel kültür adımları, büyüme deki farklılıklar ve hiPSC’nin spontan farklılaşması nedeniyle verimve fenotiplerde yüksek değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, daha standart işleme teknikleri uygulanarak ve otomasyon5kullanılarak elde edilebilen protokolleri basitleştirerek deneyciye bağımlı varyasyonun azaltılması gerekmektedir. Otomatik hiPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin oluşturulması hem akademik hem de endüstriyel araştırma projeleri için ortak standartlar belirleyecek ve biyolojik olarak ilgili hastalık modellerinin ve daha tekrarlanabilir sonuçların oluşturulmasına olanak sağlayacaktır.

Önceki çalışma hiPSC kültürlerin otomasyon çalıştı6,7,8 ama protokolleri sisteme bağlı belirli hücre kültürü plaka biçimleri ile sınırlı ve farklı test biçimlerine adaptasyon yoksun. Bu tür sistemler hücrelerin şişirilmesinde yararlıdır, ancak istenilen hücre tipleri, hastalık fenotipleme ve tarama amaçlarına otomatik farklılaşma için uygun olmayabilir. Ayrıca, fibroblast türevi, hiPSC üretimi ve farklılaşması için büyük ölçekli bir otomatik platform9 tarif edilmiştir ama sadece çekici görünüyor ama birçok akademik laboratuvarlar için karşılanamaz olabilir hatların üretimine adanmış yüksek iş gücü laboratuvarları tarafından elde edilebilir bir ölçekte.

Yüksek Verimli Partikül Hava (HEPA) filtreli bir ortamda, büyük kapasiteli CO2 kuluçka makinesi, parlak alan görüntüleme sitometresi ve plaka taşıma için robotik bir kol ile birlikte sıvı taşıma istasyonuna dayalı tam otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik. Bu bileşenler kararlı ve tekrarlanabilir hiPSC kültürü ve farklılaşması için temel sağlar. Sistemi bileşik veya virüs depolama için otomatik -20 °C depolama sistemi ve yüksek hızlı dönen disk konfokal canlı hücre görüntüleyicisi ile tamamladık. Özel yapım protokoller otomatik hücre tohumlama, medya değişiklikleri, birleştirme kontrolleri, hücre genişletme ve numune tedavisi ve plaka görüntüleme ile test plakası üretimi, sistem yüksek içerik / yüksek iş letimatları ile uyumlu hale izin oluşturuldu. Otomatik hücre kültürü ve görüntüleme sistemi, kontrol yazılımı ve özel yapım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kullanılarak işletilmektedir. GUI, kullanıcıların yöntem yürütülmesi için gereken hücre satırına özgü parametreleri içeren CSV dosyalarını almalarına olanak tanır. Ayrıca GUI, yerleşik takvim görünümünü kullanarak herhangi bir dizide çok sayıda deneme zamanlamasını sağlayarak her yöntemin başladığı zaman tam denetimini sağlar.

Otomatik hücre kültür sistemimiz, çeşitli plaka formatlarında (96-, 48-, 24-, 12-, 6- veya 1-well plaka formatında) kültür hücrelerine esneklik ile standartlaştırılmış pipetleme hızları, geçiş süreleri, birleştirme eşikleri, tohumlama yoğunlukları ve orta hacimler kullanır. Biz 6 gün içinde TUBB3 pozitif nöronlar verebilir nöronlar içine hiPSC dönüştürmek için yeni yayınlanan kısa vadeli farklılaşma protokolü uyarlanmış10,11. Ayrıca, ef1a promotörü12 ve iPSC altında GFP’yi orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronlara dönüştüren ve 65 gün içinde mDA nöronlarını veren daha önce yayınlanmış çift SMAD inhibisyonu protokol13’ü uyarlayan nöronlara (smNPC) otomatik farklılaşma ve görüntüleme yi kurduk.

Protocol

1. Hücre kültürlerini otomatikleştirmek ve görüntüleme için temel prosedürler Yeni kültür plakaları ve ipuçları yükleyin GUI’yi açın ve Kaynak/Enstrüman işlem görünümü düğmesine tıklayın. Herhangi bir kaynak/enstrüman işlemini çalıştırmak için kaynak/enstrüman işlemini seçin ve Çalıştır Enstrümanı işlem düğmesini tıklatın. Kaynak işlemini RunHepaHood ve Yeniden Yükleme çalıştırın (bkz. adım 1.1.1). Kapıyı açın, hücre kültür plakalarını ve tek kullanımlık ipuçlarını kontrol eden bilgisayardaki açılır görüntüde belirtildiği gibi ilgili konuma yükleyin. Dekontaminasyon için kapıyı etanolile silin ve kapatın. Gösterge probu DEkontaminasyonunu GUI’den çalıştırın (bkz. adım 1.1.1). Sistem 30 dakika uv radyasyonu ile sterilize olur. Kültür ortamını ve/veya dissociation reaktifini yeniden doldurun Enstrüman adımını RunHepahood’u uygulayın (bkz. adım 1.1.1). Sıvı taşıma istasyonunun ön kapısını açın. etanol içeren rezervuarları (ortam, PBS ve/veya dissosilasyon reaktifi içeren) dekontamine edin ve güverteye atanan pozitona yerleştirin (cfg.csv dosyasında tanımlandığı şekilde). Rezervuarların kapağını kapatın. Kapıyı etanolle dezenfekte edin ve kapatın. GUI’den kaynak/enstrüman işlemini “InitHepaHood” çalıştırarak HEPA kaputunu güçle. GUI’de yeni bir “Hücre hattı” oluşturma ve proje oluşturma Config (*.cfg.csv), alma (*.imp.csv), kaynak (*.rsv.csv) ve iş akışı (*.wfl.csv) dosyalarından oluşan kullanıcı tanımlı “Hücre satırı” dosyalarını oluşturun/değiştirin. GUI’yi açın ve “Hücre satırı düzenleyicisi” görünümünde hücre satırı ekle düğmesini tıklatarak yeni bir “Hücre satırı” oluşturun. Config dosyasının seçilmesi gereken bir sihirbaz açılır ve kısa açıklamalı bir proje adının girilmesi gerekir. Yeşil ok ucunu kullanarak bu sihirbazda gezinin ve yeşil onay işaretini tıklatarak ayarları onaylayın. Proje Ekle düğmesini tıklatarak oluşturulan “Hücre satırı” için yeni bir proje oluşturun. Bir proje adı ve açıklaması girin ve GUI’nin takvim görünümünde görünür olacak bir proje rengi tanımlayın. Ok ucuna tıklayarak sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin. Toplu iş ekle düğmesine tıklayarak ve açılan pencerede kısa bir ad ve açıklama vererek yeni bir toplu iş oluşturun. Tüm işlem adımlarını seçin ve her işlem adımı için başlangıç saatini zamanlayın. Tamam’atıklayarak pencereyi kapatın. GUI kullanarak otomatik bir yöntem yürütme GUI’nin takvim görünümüne gidin ve Ekle işlemi adımı düğmesini tıklatın. Hücre satırını seçin ve sihirbazın bir sonraki sayfasına geçtikten sonra projeyi seçin. Kullanılacak toplu işlemi işaretleyin ve sağa işaret eden ok ucuna tıklayın. Kullanılan yönteme bağlı olarak, toplu işlemler in boş (yeni plakalar almak için) veya kültür plakaları veya deneme plakaları (diğer tüm işlemler) içermelidir. Sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin ve yürütülecek işlem adımını seçin. Bu sihirbazın son sayfasına gidin ve denemeyi zamanlayın. “Parametre Ayrıntıları” bölümünde metodun çalıştırılması için gereken değişkenler değiştirilebilir. Tamam’ıtıklatarak onayla. CO2 kuluçka makinesine kültür ve deneme plakalarının yüklenmesiNOT: 1-kuyu plakaları genellikle toplu hücreler için kullanıldığından kültür plakaları olarak tanımlanır. Tüm çok kuyulu plakalar, adak plakaları olarak tanımlanır. Adım 1.1.1’de açıklandığı gibi GUI’den “RunHepaHood” enstrüman işlemini gerçekleştirin. ve robot kolunun önündeki kapıyı açın. Plakalar otomatik görüntüleme için yüklenirse, etanol ve tüy bırakmayan bir doku ile hesap plakalarının alt kısmını silin. Kültürü veya deneme plakalarını sol rafa yerleştirin. Plakanın yönünün doğru olduğundan emin olun. Araştırma plakaları için, kültür plakalarının kenarları sağa işaret ederken, iyi A1 robot koluna doğru işaret etmek zorundadır. Dekontaminasyon için kapıyı etanolile silin ve kapatın. Adım 1.4’te açıklandığı gibi, 1 kuyulu plakaların ithalatı için “Kültür Plakalarının Yüklenmesi” veya çok kuyulu plakaların ithalatı için “Asa Plakalarının Yüklenmesi” yöntemini uygulayın. Her iki yöntemi çalıştırmak için boş bir toplu iş kullanın. Bu toplu iş partisinde plaka barkodları zaten mevcutsa, onay kutularına tıklayarak bunları seçin. Robot kolu kullanarak raftan CO2 kuluçka platformuna tek tek plakalar taşıyın. Dahili plaka servis istasyonu plakayı alır ve co2 kuluçka raflarından birinde saklar. Hücreler 37 °C ve %5 CO2’detutulur. CO2 kuluçka makinesinden plakaların boşaltılması “Plakaları boşalt” yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). Dışa aktarılması gereken plakaları içeren toplu işlemi seçin. Tek tek plakalar barkodları ile seçilebilir. Plakaları CO2 kuluçka makinesinden robot kolu kullanarak sol rafa taşıyın. Adım 1.1.1’de açıklandığı gibi “RunHepaHood” enstrüman işlemini kullanarak HEPA kaputunu başlatın. ve robot kolunun önündeki kapıyı açın. Plakaları çıkarın, kapatmadan önce kapıyı etanolle dezenfekte edin ve HEPA kaputuna güç koyun. 2. Otomasyon protokolleri Tüplerden tabak ların tohumlanması Enstrüman işlemi RunHepaHood’u çalıştırarak HEPA kapağını başlatın (bkz. adım 1.1.1). Sıvı taşıma istasyonunun önündeki kapıyı açın. Hücre süspansiyonu içeren 50 mL’lik tüpü giriş ve tüpün kapağını kapatın. Robot kolunun önündeki kapıyı açın ve raftaki hücreleri almak için kaplamalı kültür plakaları yükleyin. Dezenfekte edin ve her iki kapıyı da kapatın. “Tüplerden plaka tohumlama” yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). Doğrudan hücre sayma işlevini kullanarak brightfield görüntüleme sitometresindeki hücreleri sayın. Hücre sayımı için, 384 kuyulu plaka biçiminde çoğaltma olarak 16 kuyu kullanın. 384 kuyulu sayma plakasını robot kolu kullanarak pikap üzerinden güverteden brightfield görüntüleme sitometresine taşıyın ve görüntüleme işlemini başlatın. Sitometre mililitre başına hücre numarasını otomatik olarak belirler. Robot kolu kullanarak sayma plakasını orijinal konumuna getirin. Robot kolu kullanarak raftan boru lama güvertesine kaplamalı bir kültür veya deneme plakası taşıyın. Kaplama ve tohum hücrelerini kullanıcı tarafından tanımlanan sayı ve plaka biçimine uygun hacimolarak kaldırın (bkz. Tablo 1). Hücre dağıtımı ve CO2 kuluçka makinesine aktarmak için plakayı 500 rpm’de 10 s’lik güverteshaker’a taşıyın. Otomatik kesişme değerlendirmesi Adım 1.4’te açıklandığı gibi “Birleşimi Denetle” yöntemini uygulayın. En az bir kültür plakası ve hiçbir deneme plakası içeren bir toplu iş seçin. Görüntü edinme ve görüntüleme analizi ayarları için “Parametre Ayrıntıları” girişi “iPSCf_2020” bölümünde. Co2 kuluçka makinesinden ilk plakayı robot kolu kullanarak pikap aracılığıyla brightfield görüntüleme sitometresine taşıyın. HiPSC kolonilerinin birleşimi kontrolü için brightfield görüntüleme sitometresindeki hücrelerin görüntülenmesi. 1-iyi pate “birleştirme” uygulaması ve görüntü 13 alanları kullanın ve otomatik olarak hücrelerin kaplar tarafından işgal ortalama alanı hesaplamak. Plakayı robot kolu kullanarak CO2 kuluçka makinesine geri götürün. Adımları 2.2.2’yi yineleyin. 2.2.4’e kadar. kalan plakalar için. Kültür plakalarının veya deneme plakalarının medya değişikliği Adım 1.4’te açıklandığı gibi “Kültür Plakalarının Medya Değişikliği” yöntemini uygulayın. ve yalnızca kültür plakaları içeren bir toplu iş seçin. “Parametre Ayrıntıları” bölümündeki pipetleme adımları için uç veya iğne kullanıp kullanmadığını belirten değişkeni ayarlayın. Herhangi bir çok kuyulu plakanın ortam değişikliği için “Ataşe Plakalarının Medya Değişimi” yöntemini uygulayın ve test plakaları içeren bir toplu iş seçin. Robot kolu kullanarak CO2 kuluçka makinesinden tek tek plakaları güverteye taşıyın ve plakaların kapağını kapatın. Plakaları otomatik olarak yatırın ve eski ortama aspire edin ve atık toplama modülüne atın. 12 mL taze ortam ekleyin. Plakayı yeniden kapatın ve robotik kolu kullanarak plakaları CO2 kuluçka makinesine geri götürün. Alt TarımNOT: 1.1.1’de açıklandığı gibi GUI’den “RunHepaHood” enstrüman işlemini gerçekleştirin. ve sıvı taşıma istasyonunun ön kapısını açın. Gerekli konumlara ortam ve dissosiasyon reaktifi yükleyin (bkz. adım 1.2). İpuçlarının yeniden doldurulması gerekiyorsa, adım 1.1’de açıklandığı gibi “Yeniden Yükleme”yi kullanın. Hücre süspansiyonu almak için 50 mL’lik bir tüp giriş ve tüpün kapağını kapatın. “Yapışık Hücrelerin Alt Ekimi” yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). Alt ekimi gereken kültür plakaları içeren toplu işlemi seçin. Robot kolu kullanarak co2 kuluçka makinesinden güverteye plakaları taşıyın ve plakaların kapağını kapatın. Plakaları otomatik olarak yatırın ve eski ortamı çıkarın ve atık toplama modülüne atın. 8 mL PBS ile hücreleri bir kez yıkayın. Küme tabanlı geçiş için 0,5 mM EDTA 8 mL ekleyin. 8 dakika güvertede kuluçka. EDTA çözeltisini plakalardan çıkarın ve atık toplama modülüne atın. 12 mL taze orta ekleyin ve plakaları çalkalayıcıya taşıyın. Kolonileri yerinden çıkarmak için 1 dakika için 2000 rpm çalkalayın. iPSC kolonilerini daha küçük bir boyuta (~50\u201280 μm) kırmak için hücre süspansiyonuna beş devre boru lama için triturate. Hücre süspansiyonuna güvertedeki 50 mL’lik bir tüpe aktarın. Tohum hücreleri otomatik olarak adım 2.1.5 olarak 7 1 bir split oranı kullanarak açıklandığı gibi.NOT: İsteğe bağlı, tek hücreli geçiş. Tek hücreli dissosasyon reaktifini kullanarak tek hücreli süspansiyon oluşturun (bkz. Adım 2.4.2’de 0.5 mM EDTA yerine, tek hücreli ayrışma reaktifinin 8 mL’sini kullanın ve 37 °C’de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonunu 50 mL’lik bir tüpe toplayın ve eşit hacimli ortam ekleyin. Tek hücreli ayrışma reaktifini kullanarak ayrıştırma, hücreleri peletlemek için manuel bir adım gerektirir. 3 dk için 300 x g santrifüj hücreleri. Supernatant çıkarın ve gerekli ortam 12 mL hücre pelet resuspend ve “Tüplerden plakaların tohumlama” ile devam (adım 2.1 bakınız). HiPSC’lerin tek hücreli süspansiyonu kullanırken tohumlama gününde medyayı 2 μM tiazovivin ile tamamlayın. Otomatik yüksek içerikli, yüksek iş elde görüntülemeNOT: Ölçüm ayarı kullanılabilir olmalıdır (bkz. Ek Dosya 1: adım 1.1). Görüntülenecek teşp plakaları kuvözde mevcuttur. “Görüntüleme” yöntemini uygulayın (bkz. adım 1.4). En az bir deneme plakası ve kültür plakası içermeyen bir toplu iş seçin. “Parametre Detayları” bölümünde plaka tipini, plaka tanımlarını (standart 96-iyi görüntüleme plakaları için: “Plate-96-2017091813842”) ve ölçüm ayarının adını girin. Görüntüleme işlemini başlatmak için robotik kolu kullanarak otomatik konfokal mikroskoba pikap üzerinden hesap plakası taşıyın. Görüntülemenin sonundaki plakayı mikroskoptan kurtarın ve CO2 kuluçka makinesine geri götürün. Kalan plakaların toplu olarak işlemini tekrarlayın. 3. HiPSC’nin otomatik bakımı ve genişletilmesi Otomatik birleştirme denetimleri, ortam değişiklikleri ve alt ekimi sırası “Tüplerden tabak ların tohumlanması” yöntemini kullanarak 1 kuyu plakalı tohum hücreleri (bkz. adım 2.1). Alternatif olarak, “Kültür plakasının yüklenmesi” yöntemini kullanarak elle tohumlanmış 1-kuyu plakalarını alın (bkz. adım 1.5). IPSC kültürünün 1.günden 6.gününe kadar koloni büyümesini izlemek için günlük otomatik birleştirme denetimleri zamanlayın (bkz. adım 2.2). “Kültür plakalarının medya değişikliği” yöntemini kullanarak her iki günde bir ortamı yenileyin (bkz. adım 2.3). Plaka başına 12 mL orta kullanılır. 6. günde “Subcultivation” işlemini başlatın (bkz. adım 2.4.). 4. Otomatik farklılaşma Kortikal NGN2 nöronlar için İnsan iPSCNOT: Manuel hiPSC hazırlığı. Protokol, teslimat için lentiviral vektörler kullanarak NGN2 aşırı ifade içerir. NGN2 ile transduce hiPSC ile rTTA3 lentivirus bir 1:2 oranı (> ~ 107 TU/mL). Hücreler daha sonra 0.5 μg/mL puromisin içeren bir pasaj için seçilir. Kararlı hiPSC-NGN2 satırları oluşturmak için ayrıntılı bir protokol Ek Dosya 1:adım 2’de yer almaktadır. Adım 2.4.4 notunda açıklanan tek hücreli dissosiasyon reaktifi kullanılarak açıklandığı gibi “Subcultivation” işlemine devam edin. hiPSC ulaştığında 70\u201280% birleşme 2,5 g/mL doksisiklin (doks) ve 2 μM tiazovivin içeren 12 mL NGN2 ortam(Malzeme Tablosu)içinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletini yeniden askıya alın. “Plakaların tüplerdenTohumlanması” yöntemini kullanarak farklılaşmaya başlayın (bkz. adım 2.1). iPSC’nin istenilen tohumlama yoğunluğunu 30.000/cm2 olarak ayarlayın (tablo 1’e bakın). iPSC, 0.1 mg/mL poli-L-ornitin (PLO) ve 5 μg/mL laminile önceden kaplanmış plakalara kaplanır.NOT: RNA ve proteomik temelli çalışmalarda 1-kuyu plakaları tercih edilirken, görüntüleme deneyleri için 96 kuyulu plaka formatı tercih edilmektedir. 48, 24, 12 veya 6-well plakalar gibi diğer ispon plaka biçimleri de kullanılabilir. Farklılaşmanın birinci gününde, 2.5 μg/mL dox ve 10 μM N-[2S-(3,5-diflorophenyl)asetil]-L-alanyl-2-fenil-glisin, 1,1-dimetil ester (DAPT) ile desteklenen NGN2 ortamını kullanarak “araştırma plakalarının medya değişimi (bkz. adım 2.3) kullanarak ortam yenileyin. İstenilen farklılaşma gününe kadar her 2\u20123 günde bir ortam değişikliklerine devam edin (bkz. adım 2.3). Farklılaşmanın 4. gününde, olgunlaşmayı artırmak için 10 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), 10 ng/mL glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) ve 10 ng/mL nörotrofik faktör (NT-3) ile desteklenen NGN2 ortamını kullanarak başka bir medya değişikliği (bkz. adım 2.3.) gerçekleştirin. Deneyin sonunda, alt akım deneyleri için sistemden kültür plakalarını dışa aktarın (bkz. adım 1.6). KÜÇÜK molekül nöral öncühücreleri (smNPC) NGN2 nöronlar içinNOT: Yayınlanan protokol12’nin uyarlanmış sürümünü takip eden smNPC türetin (bkz. Ek Dosya 1: adım 5). SmNPC’yi NGN2 ve rTTA3 virüsüyle değiştirin (Bkz. Ek Dosya 1: adım 2). Bir tur NGN2 ve rTTA transdüksiyonistikrarlı bir popülasyon oluşturmak için yeterlidir. Ayrıca canlı hücre izleme gerçekleştirmek için izin pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus ile smNPC değiştirin. GFP lentiviral transdüksiyoniçin 10 enfeksiyon (MOI) çokluğu kullanılır. Adım 2.4’te açıklandığı gibi tek hücreli dissosyasyon reaktifi kullanılarak biraraya ulaşmada geçiş smNPC. Roman Otomatik hücre kültür sistemini kullanarak 50.000/cm2 hücre yoğunluğunda “Tüplerden tabak ların tohumlanması” yöntemi (bkz. adım 2.) 0.1 mg/mL FKÖ ile önceden kaplanmış plakalara ve NGN2’de 5 μg/mL laminin 2.5 g/mL doks ile desteklenmiştir. 3. gün, 2,5 g/mL doks ve 10 μM DAPT içeren taze NGN2 ortamını kullanarak bir ortam değişikliği gerçekleştirin (bkz. adım 1.3.). 3. günden sonra, her biri 10 ng/mL’de 2,5 g/mL dox, BDNF, GDNF ve NT-3 içeren taze NGN2 ortamı yla her üç günde bir ortam değişiklikleri gerçekleştirin. Görüntü hücreleri günlük “Otomatik yüksek içerik, yüksek iş yapma görüntüleme” yöntemini kullanarak (bkz. adım 2.5) neurite outgrowth için okuma olarak GFP kullanarak farklılaşma durumunu izlemek için. Lazer gücünü ‘e ayarlayın ve 30 ms’lik bir pozlama süresi kullanın. 20x hedefini kullanarak çok sayıda alan (örneğin, 25 alan) edinin. Toplu görüntü analizi Neurite outgrowth şablonu kullanarak görüntü analizi yazılımı 1 ile görüntü analizi gerçekleştirin. Yazılımı açın. “Veri” seçeneğini seçin ve görüntüleme veri klasörüne göz atın, analiz edilecek verileri yüklemek için tamam’ı tıklatın. Aç’ı tıklatın ve üst menü çubuğundan protokol seçin ve uygulama menüsünden neurite outgrowthseçin. “Algoritmalar” gidin ve çekirdek, hücre gövdesi ve neurite tanımlamak için “488” kanalını kullanın. Her biri için eşik parametrelerini ayarlayın. Görüntü analizi için kullanılacak kuyuları seçin. Sağ alttaki linke tıklayın ve hücre sayısı ortalaması, toplam iskelet uzunluğu toplamı gibi analiz edilecek özellikleri seçin. “Ön analiz” ve ardından “önizleme” ile devam edin. Önizleme ayarlarının kabul edilebilir olup olmadığını kontrol edin ve toplu iş modunda çözümlemeye başlayın. Sonuçlar, excel’de açılabilir .csv dosya biçiminde “raporlar” altında ana klasörde kullanılabilir.NOT: Görüntü analizi komut dosyası istek üzerine kullanılabilir. Toplam neurit uzunluğu ile elde edilen arsa ortalama neurit uzunluğu hücre sayısına normalleştirilmiştir. 5. HiPSC’nin orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlara otomatik farklılaşması Manuel hiPSC hazırlığı Tek hücreli ayrışma reaktifini kullanarak 70\u201280% confluent hiPSC’yi tek hücrelere ayırın. Kısaca, 37 °C’de 30 dakika boyunca tek hücreli ayrışma reaktifi (100 μL/cm2)ile inkübasyon hücreleri, konik bir tüp, 200 x g’de 5 dk için santrifüj ve iPSC kültür ortamında hücre peletini yeniden askıya almak için hücre süspansiyonunu toplar. Hücre dışı matris kaplı 1 kuyulu plakalar üzerinde 200.000 hücre/cm2 ve 10 μM Y-27632 ile desteklenen iPSC kültür ortamı. Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve %5 CO2’de. Otomatik farklılaşma: Faz 1 Adım 1.1\u20121.2’de açıklandığı gibi otomatik kültür sistemini hazırlayın. Otomatik kültür sisteminin CO2 kuluçka makinesine hücreleri içeren kültür plakalarını yükleyin (bkz. adım 1.5). KSR ortamını hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu)ve küçük moleküllerle tamamlayın (bkz. Tablo 2) farklılaşmanın başlangıç günü 0 için gereklidir. Küçük moleküller ve büyüme faktörleri ile sadece taze hazırlanmış medya kullanın. 2.3. basamakta açıklandığı gibi kültür plakalarında medya değişikliklerini 0 ve 1 gün farklılaşma günlerini ve ardından 25. 5. günden itibaren, tablo 3’teayrıntılı olarak açıklandığı şekilde medya formülasyonlarını kademeli olarak kaydırın. 11. günde, CHIR (13. güne kadar), BDNF, AA1, GDNF, db-cAMP, TGFß3 ve DAPT ile desteklenen mDA nöron farklılaşma ortamını ekleyin (Malzeme Tablosunabakın). 25. günde, plakaları boşaltın (bkz. adım 1.6.) Manuel rekaplama 1 Tek hücreli ayrışma reaktifini kullanarak 25 mDA’lık gün öncüllerini tek hücrelere ayırın. Kısaca, tek hücreli ayrışma reaktifi olan (100 μL/cm2) 37 °C’de 40 dakika boyunca inkübasyon hücreleri, konik bir tüpe hücre süspansiyonu, 5 dk için 200 x g’de santrifüj ve mDA nöron farklılaşma ortamında hücre peletini yeniden askıya alır. Tohum 400.000 hücre/cm2 1-iyi kültür plakaları önceden kaplanmış 0.1 mg/mL FKÖ, 10 g/mL laminin ve mDA nöron farklılaşma ortamı 2 μg/mL fibronektin ile takviye 10 μM Y-27632 (26 güne kadar) ve küçük moleküller ve büyüme faktörleri Tablo 2açıklanan . Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve %5 CO2’de. Otomatik farklılaşma: Faz 2 Adım 1.5’te açıklandığı gibi otomatik kültür sisteminin CO2 kuluçka makinesine mDA nöronları içeren yük kültür plakaları MDA nöron farklılaştırma ortamı (bkz. Malzemeler Tablosu)ve 26. Farklılaşmanın 26.NOT: Yüksek iş lenme amaçlı olarak, adım 5.5’te açıklandığı gibi, 32. Manuel rekaplama 2 Adım 1.6’da açıklandığı gibi kültür plakalarını boşaltın. Adım 5.3.1’de açıklandığı gibi 32 mDA nöronları tek hücrelere ayırın. 10 μM Y-27632 (33 güne kadar) ve küçük moleküller ve büyüme faktörleri ile desteklenen mDA nöron farklılaşma ortamında 0.1 mg/mL FKÖ, 10 g/mL laminin ve 2 μg/mL fibronektin ile önceden kaplanmış 96 kuyulu plakalarda 100.000 hücre/cm2 tohum (Bkz. Tablo 2). Kültür hücreleri bir gecede 37 °C ve %5 CO2’de. Gün 33, taze hazırlanmış DA nöronlar farklılaşma orta küçük moleküller ve büyüme faktörleri ile takviye (Y-27632 olmadan) orta değiştirin. 65. güne kadar her 3\u20124 günde bir orta yı el ile değiştirin. 6. İmmünoboyama, otomatik yüksek iş hacmi görüntü edinimi ve analizi Floresan boyama Ek Dosya 1:adım 4’te açıklandığı gibi floresan immünoboyama yapın. Ek Dosya 1’deaçıklandığı gibi görüntü hücreleri : adım 1.2. 6.2 adımda açıklandığı gibi, daha fazla görüntü analizi için görüntüleme sistemi tarafından oluşturulan görüntüleme dosyalarını görüntü analiz yazılımı 2’ye (bkz. Görüntü analizi yazılımı 2 kullanarak görüntü analizi Görüntüleme dosyaları görüntü analizi yazılımı 2’ye yüklendikten sonra “görüntü analizi” işlevine gidin ve açılan menüyü kullanarak analiz algoritmasını oluşturun. Hücre çekirdeğine ait görüntüdeki bölgeleri algılayan “çekirdekleri bul” görevini kullanarak çekirdekleri seçin (burada Hoechst ile boyanmış). Çekirdekleri ölü hücrelerden (pyknotic çekirdekleri) nükleer alan veya çap için bir eşik belirleyerek hariç tutarak. “sitoplazmayı bul” görevini kullanarak hücre sitoplazmasını seçin. Bu görev hücre sitoplazmasına ait çekirdeklerin çevresindeki bölgeleri algılar. Yalnızca iyi parçalı hücreleri ekleyin. Mitotik, apoptotik ve kötü parçalı hücreleri hariç tinler. Görüntünün kenarlığı dokunan hücreleri kaldırın. “Morfoloji özelliklerini hesapla” ve “yoğunluk özelliklerini hesapla” görevlerini ekleyin. Morfoloji parametreleri, ilgi çeken bir bölge için alan gibi morfoloji özelliklerinin hesaplanmasını içerir. Yoğunluk parametreleri, bir ilgi bölgesinin ortalama yoğunluğu (örn. nöronların sitoplazması) gibi yoğunluk özelliklerinin hesaplanmasını içerir. Bir veya daha fazla koşul, morfoloji ve/veya yoğunluk kullanarak giriş popülasyonunun (seçilen tüm sitoplazmalar) bir alt popülasyon (örneğin, TH pozitif nöronlar) seçin.NOT: Genellikle nöronlar için yoğunluk seçilir. Negatif kontrollere dayanarak, nöronların TH için pozitif olarak kabul edilen yoğunluk eşiğini yukarıda tanımlamak mümkündür. Çıktı sonuçlarını tanımlayın. Bu her analizin son yapı taşı. Bir kültür plakasının her kuyusu için tahmon okuma değerlerini tanımlar (kuyu başına sonuçlar). Toplu iş çözümlemesi çalıştırın ve sonuçları dışa aktarın. Pozitif hücre sayısını toplam çekirdek sayısına normalleştirin ve verileri pozitif hücrelerin yüzdesi olarak temsil edin. 7. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) Ek Dosya 1:adım 3’te açıklandığı gibi qRT-PCR protokolünü gerçekleştirin.

Representative Results

Otomatik hücre kültürümüz ve görüntüleme sistemimiz, hiPSC ekimini ve kortikal veya orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronlar gibi farklı hücre tiplerine farklılaşmasını standartlaştırmamıza olanak tanıyan insan müdahalesini en aza indirmek üzere tasarlanmıştır. Entegre görüntüleme cihazları ile otomatik hücre kültür sistemimizin şematik bir özeti Şekil 1’degösterilmiştir. Hücre kültürlerinin bu otomatik hücre kültür sistemine ilk girişi ya 50 mL’lik bir tüpten hücreleri otomatik olarak tohumlayarak ya da kültür veya analiz plakalarının ithalatı için “Kültür Plakalarının Yüklenmesi” veya “Assay Plakalarının Yüklenmesi” yöntemi kullanılarak yapılabilir. Sistemimizin merkezi bir bileşeni, ortam değişiklikleri veya alt tarımlar gibi tüm sıvı transfer adımlarının gerçekleştirildiği sıvı taşıma istasyonudur. Sıvı işleyicisinin özel yapım güverte düzeni Şekil 2’detemsil edilmektedir. Sıvı taşıma istasyonu dört pozisyon ile donatılmıştır. En fazla dört plaka paralel ortam değişiklikleri sağlayan, güverteye kuvözden transfer edilebilir. Alt tarım yönteminde hem ebeveyn hem de kız kültür plakalarının güvertede yer alması gerektiği için, paralel olarak işlenen en fazla kültür plakası sayısı iki ile sınırlıdır. Sıvı işleme istasyonunun önemli bir özelliği, hücre kültürünün tamamen kaldırılması için ortam değişimi sırasında plakaları yatırma imkanıdır. Ayrıca, sıvı işleme istasyonu subcultivation protokolünün yürütülmesi sırasında hücrelerin enzimatik dissociation lehine shakers ile donatılmıştır. Otomatik kültür sistemimiz aynı zamanda iki görüntüleme sistemi yle donatılmıştır: hücre sayımı ve birleştirme kontrolleri için parlak alan görüntüleme sitometresi ve bu nedenle zaman içinde hücre büyümesini izlemek ve hücrelerin hızlı, yüksek içerikli ve yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için çift dönen disk konfokal mikroskobu. HiPSC kültürleri brightfield görüntüleme sitometrede büyüme için günlük olarak izlenir ve birleşim yüzdesi için analiz edilir. Sol panelde ve sağ panelde brightfield görüntü sitometre ile elde edilen brightfield görüntü analizinden yeşil bir maske (Şekil 3A). Paralel olarak yetiştirilen ve 1.günden güne 6’ya kadar kesişme kontrollerine tabi tutulan iki hiPSC hattının (n = 4 plaka) birleştiği yüzdelerde gösterildiği gibi, zaman içinde homojen bir hiPSC büyümesi gözlenir(Şekil 3B). Belirlenen eşiğe ulaştıktan sonra hiPSC geçiş yapılır. Hücre hatları elle (m) veya otomasyon (a) sistemi tarafından kültürlenmiş ve tipik kök hücre morfolojisinin en az iki pasaj, temsili brightfield görüntüleri için sürdürülmesi için gözlenmiştir(Şekil 4A). El ile kültürlü hiPSC (gösterilmez) veya otomatik sistemde tipik kök hücre belirteci OCT4 (kırmızı) ve SSEA4 (yeşil), immünororesans analizinde gösterildiği gibi(Şekil 4B)sergilendi. PLuripotency belirteçleri OCT4, NANOG ve REX1 ekspresyonu da qRT-PCR (Şekil 4C) ile mRNA düzeyinde değerlendirildi. Göreli nicelemeler, elle yetiştirilen bir hücre hattından (m) ve otomatik kültür sisteminden (a) yinelenen (1 ve 2 çoğaltma) alınan örneklerle gerçekleştirilmiştir. Otomatik kültür sisteminde ekili çoğaltmalar her üç pluripotency belirteçleri ifade düzeyleri manuel kültür sonra marker ifade benzer. 8. günde (D8), pluripotens belirteçlerinin ekspresyonu hiPSC’den ayırt edilen kortikal nöronlarda (Diff) yoktu. Otomatik kültür sisteminin önemli bir uygulaması, hiPSC’nin nöronlar da dahil olmak üzere farklı hücre tiplerine farklılaşmasıdır. Burada çok kısa bir süre içinde (yaklaşık 6 gün) saf kortikal nöron kültürü üreten NGN2 stratejisini kullanarak nöronlara hiPSC farklılaşmasını gösteriyoruz. Otomatik kültür sisteminde farklılaşan nöronlar (a) manuel olarak yetiştirilen nöronlar (m)(Şekil 5A)olarak benzer morfoloji ve nöronal ağ organizasyonu sunmuştur. Otomatik diferansiye kortikal nöronlar TUBB3 (nörona özgü Sınıf III β-tubulin, kırmızı) ve BRN2 (üst kortikal tabaka belirteci, yeşil)(Şekil 5B)için pozitifti, manuel olarak farklılaştırılmış nöronlarla karşılaştırılabilir (veriler gösterilmedi). Mikrotübül ilişkili protein 2(MAP2),nöral hücre adezyon molekülü(NCAM1)ve Synapsin-1(SYN1)gibi nöronal belirteçlerin yanı sıra kortikal nöron belirteçleri BRN2 ve CUX1 (üst kortikal tabaka) gibi nöronal belirteçlerin ekspresyonu 8.gün (D8) farklılaşmanın nöronlarda zenginleştirilmiştir (Şekil 5C). HiPSC’de bu belirteçlerin çok düşük veya hiç ekspresyonu gözlenmedi. Göreli nicelemeler, elle yetiştirilen bir hücre hattından (m) ve otomatik kültür sisteminden (a) yinelenen (1 ve 2 çoğaltma) alınan örneklerle gerçekleştirilmiştir. Çoğaltmadaki ifade düzeyleri, el ile ve otomatik farklılaştırmalar arasında benzer varyasyonlar gösterir. Otomatik kültür sisteminin entegre görüntüleme yeteneği, kültürlerin sağlığı için eller serbest veri toplama olanağı sağlayarak fenotipik okumaların uzun süreli otomatik olarak kazanılmasını sağlar. GFP lentivirus ile transek küçük bir molekül türetilmiş nöral öncül (smNPC) hattına NGN2 yaklaşımını kullanarak, herhangi bir manuel müdahale olmaksızın 11 günlük farklılaşma süresinin ölçüldüğü canlı hücre otomatik neurite outgrowth çıktısı oluşturduk. 1, 3 ve 11. Farklılaşmanın 1.günden 11’e kadar olan nötrit uzunluğundaki artış ölçüldü ve farklı kuyularda benzer bir gelişme gösterdi. Basitlik adına, 96 kuyulu bir plakadan her biri 6 kuyuiçeren sadece 3 sütundan elde edilen veriler temsili grafikte gösterilmiş, ancak tüm iç 60 kuyu analiz edilmiştir(Şekil 6C). Burada gösterilen otomatik kültür sisteminin bir diğer uygulaması da hiPSC’nin mDA nöronlarına farklılaşmasıdır. Farklılaşma, önceden belirlenmiş bir protokolü takiben medya değişikliklerine dayanır ve 0’dan 65’e kadar otomatik kültür sisteminde gerçekleştirilir. Otomatik ortam değişiklikleri hücre kopması veya farklılaşma da başka bir görsel olarak algılanabilir değişikliklerneden olmadı. Farklılaşmanın sonunda, 65. mRNA düzeyinde, otomatik kültür sisteminde farklılaşan mDA nöronları sırasıyla nöronal ve mDA belirteçleri, MAP2 ve TH (tirozin hidroksilaz) ekspresyonunu göstermektedir(Şekil 7C). Her iki farklılasyon da önemli miktarda TH ve MAP2 pozitif nöron üretilmiştir(Şekil 7D). Şekil 1: Otomatik hücre kültürü ve görüntüleme platformunun şematik genel bakışı.Sistem, hücre kültürü uygulamaları için steril bir ortam sağlayan dört UV lambası ile donatılmış iki HEPA davlumbaz (A ve B) ile tasarlanmıştır. Hücre kültürü plakaları ön kapı (C) üzerinden erişilebilen robotik kol önündeki raflara yüklenir. Plakalar 456 plaka kapasiteli CO2 kuluçka makinesine (D) yüklenir. Bir brightfield hücre sitometresi (E) alt ekim rutinleri sırasında birleştirme kontrolleri ve hücre sayma için kullanılır. Sıvı taşıma istasyonu HEPA davlumbazlarından (B) altındadır. Sıvı işleyicisinin güverte düzeni Şekil 2’deaçıklanmıştır. Sıvı taşıma istasyonunun borulama kolu 96 kanallı pipetleme kafası, sekiz adet 1 mL pipetleme kanalı ve dört adet 5 mL borulama kanalı taşır. 1 mL borulama kanalları nda sıvı transferleri için uçlar veya iğneler kullanılabilir. Tarama amacıyla, test plakalarında tohumlanan hücreler, bu numuneleri ikinci bir kuluçka makinesinde (G) eritildikten sonra otomatik -20 °C depolama sisteminde (F) -20 °C’de saklanan numunelerle tedavi edilebilir. Yüksek iş elde görüntüleme otomatik konfokal mikroskop (H) iki dönen disk veya epifloresan modunda kullanarak konfokal modda görüntü elde etmek için sunan gerçekleştirilir. Mikroskoba entegre edilmiş bir canlı hücre odası kültürlü hücrelerin uzun süreli görüntülenmesine olanak sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Sıvı taşıma istasyonunun güverte düzeni.İpucu pozisyonları 50 μL ipuçları için “50°L”, 300 μL ipuçları için “standart” ile, 1 mL uçlar için “yüksek” ve 5 mL uçlar için “5 mL” ile gösterilir. Güverte bileşenleri: (A) Herhangi bir kültür plakası veya deneme plakası formatı için kullanılabilen dört ısıtmalı shaker pozisyonu (maksimum hız: 2500 rpm). Çalkalayıcı konumları, güverteye yapılan taşımaları takiben plaka hizalaması için de kullanılan kelepçelenebilir kavrayıcılarla donatılmıştır. Ayrıca, shaker pozisyonları sıvı transfer adımları sırasında plakalar için bir kapak park pozisyonu olarak işlev. Temsili amaçlar için, tüm shaker pozisyonları 96 iyi assay plakaları tarafından işgal edilmiştir. (B) Herhangi bir formattaki dört plakayı aynı anda işlemek için dört eğim modülü en üste yerleştirilir. En düşük konum kültür ve deneme plakaları için atık toplama odası ve 96 kanal lı borulama kafasını işaretler. Temsili amaçlar için, tüm eğim modülleri 96-well plakaları tarafından işgal edilmiştir. (C) Üst konumda, hücre sayma için 384 kuyulu plaka bulunur. Aşağıda temsilamaçlı 96 kuyulu plakalar tarafından işgal edilmiş plakalar için iki pozisyon ve dört 50 mL ve dört adet 15 mL tüp için bir raf bulunmaktadır. En düşük konum 5 mL ipucu ile kaplanır. (D) Ortam rezervuarları için konumları olan üç ortam satırı. Ortam hatları, ortam haznesini 250 mL’ye kadar ortamla otomatik olarak doldurmaya olanak tanıyan sıvı seviye sensörlerine sahiptir. (E) Aktif drenajlı iki sıvı atık modülü üst üste, bir konteyner (beyaz) pozisyonu na sahip sıcaklık kontrollü bir modülün altında ve 5 mL uçlu raf bulunur. (F) 1 mL ipucu için beş pozisyon. (G) Sıcaklık kontrollü iki modül alta, bir de kapaklarının üst te stoğa yerleştirilmiş tir. (H) Üstteki iki 50 μL iç içe uçlu uç rafı (NTR) için pozisyonlar ve ardından tek kanallı iki pozisyon ve 300 μL’lik 96 kanallı top alma ve alt kısımda 5 mL uçlu raf. (I) Üstte 384 kuyulu sayma plakaları için bir istifleyici ve ardından üç adet 300 μL NTR ve alt kısmında 5 mL uçlu raf. (J) Sekiz yeniden kullanılabilir metal 1 mL iğneüç set depolama ve yıkama istasyonu. (K) Güvertede taşıma basamakları için kullanılan 1 mL ve 5 mL boru kanalları ve boş NTR (gri) için atık konumu ve 1 ve 5 mL kanallar (beyaz) için bir kavrayıcı bloğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: hiPSC’nin otomatik kesişme kontrolü.(A) Hücre sitometresi (solda) tarafından çekilen hiPSC’nin temsili brightfield (BF) görüntüleri ve yeşil deki hücrelerin kapattığı orantılı alanı gösteren otomatik birleşme analizinden (sağda) sonra; (B) Kültür, n = 4 1-iyi plakalar kültür gün 1-6 iki hiPSC satır (iPS #1 ve #2) kaydedilen birleştirme yüzdeleri hücre hattı başına 4 1-iyi plakalar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: HiPSC’nin geçişi.(A) bir hiPSC hattının BF görüntüsü el ile (solda) ve otomatik kültür sistemi (sağda) kullanılarak büyütülür. Görüntüler ikinci geçişten 6 gün sonra çekildi; (B) Pluripotency belirteçleri OCT4 ve SSEA4 için boyanmış hiPSC temsili görüntüler ve Hoechst 33342 (Nuclei) ile sayaç; (C) Pluripotency belirteçleri OCT4için qRT-PCR sonuçları, NANOG ve REX1 bir hiPSC hattında yinelenen (1 ve 2) manuel olarak yetiştirilen (m) ve otomatik kültür sistemi (a) ve ilgili hiPSC kaynaklı kortikal nöronlar (Diff) gün 8 (D8) farklılaşma. Veriler, referans örneği olarak iPS_a_1 kullanılarak nispi miktar (RQ) olarak temsil edilir. Hata çubukları, qRT-PCR reaksiyonunun 3 teknik çoğaltmasından standart sapmayı (SD) temsil eder. GAPDH, RPL13A1 ve RPLPO temizlik genleri olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: İnsan iPSC kaynaklı kortikal nöronlar.(A) Brightfield görüntüleri gün 6, manuel (m) ve otomatik (a) benzer nöronal ağları gösteren kortikal nöronlar ayırt; (B) Farklılaşmanın 8. (C) Kortikal nöronların marker genleri için qRT-PCR sonuçları (MAP2, BRN2, CUX2, NCAM1 ve SYN1) gün 8 (D8) farklılaşma zenginleştirilmiş. Veriler, referans örneği olarak iPS_a_1 kullanılarak nispi miktar (RQ) olarak temsil edilir. Hata çubukları QRT-PCR reaksiyonunun 3 teknik çoğaltmasından SD’yi temsil eder. GAPDH, RPL13A1 ve RPLPO temizlik genleri olarak kullanıldı. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Neurite outgrowth için yüksek iş çıkışlı bir çıkış çıktısı.(A) Farklılaşmanın 1, 3 ve 11. (B) Farklılaşmanın 1, 3 ve 11. Neurite outgrowth yüksek içerikgörüntü analizi yazılımı 1 kullanılarak ölçüldü ve neurite uzunluğu olarak temsil edilir; (B) Grafik NPC türetilmiş NGN2 nöronlarda nörit uzunluğu artış ve yoğun bir ağ oluşumu görüntüler. İç 60 kuyuda bulunan 96 kuyulu üç tabak görüntülenmiş. Basitlik için, 96 kuyulu plaka başına sadece üç kuyu sütunu, sütun başına n = 6 kuyu ile örnek olarak gösterilir. Kuyu başına ortalama 1308 hücre analiz edildi. Hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil eder (S.E.M.). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: İnsan iPSC kaynaklı mDA nöronlar.Orta beyin DA nöronlar manuel olarak ayırt (m) ve otomatik (a) kültür sisteminde. (A, B) Tirozin hidroksilaz (TH, mDA nöron belirteci; yeşil), MAP2 (nöronal marker; kırmızı) ve Hoechst 33342 (çekirdekler; mavi); (C) MDA nöronların marker genleri için temsili qRT-PCR sonuçları manuel olarak ve otomatik kültür sisteminde ayırt edilir. TH ve MAP2 ekspresyon düzeyleri, ev tutma genlerine(OAZ1 ve GAPDH)normalleştirilmiş göreli miktar (RQ) olarak gösterilir; (D) Manuel ve otomatik farklılaşma ile oluşturulan TH ve MAP2 pozitif nöronların yüzdeleri. Hata çubukları, iki farklı iPSC satırı (#1 ve #2) ile gerçekleştirilen iki bağımsız farklılaştırmanın SD’sini temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Hücre tipi Amaç Protokol adımı Hücre yoğunluğu Plaka biçimi Hücre numarası/kuyu NGN2 farklılaşması iPSC NGN2 kararlı hat üretimi S.2.3. 30.000 hücre/cm2 12-iyi 1,17,000 iPSC NGN2 nöron farklılaşması 3.1.3. 30.000 hücre/cm2 1-iyi 25,20,000 iPSC NGN2 nöron farklılaşması 3.1.3. 30.000 hücre/cm2 96-iyi 9,600 smNPC üretimi smNPC Replating gün 12 ve 16 S5.9. ve S5.11. 70.000 hücre/cm2 6-iyi 6,72,000 smNPC 5. geçitten rekaplama 5.11. 50.000 hücre/cm2 6-iyi 4,80,000 smNPC ngn2 nöronlar için smNPC 3.2.2 50.000 hücre/cm2 96-iyi 16,000 mDA farklılaşması iPSC mDA nöron farklılaşması 4.1.2. 200.000 hücre/cm2 1-iyi 1,68,00,000 DA nöronlar Gün 25 replating 4.3.2. 400.000 hücre/cm2 1-iyi 3,36,00,000 DA nöronlar Gün 25 replating 4.5.2. 100.000 hücre/cm2 96-iyi 32,000 Kaplama Amaç Protokol adımı Konsantrasyon/Seyreltme Plaka biçimi Kaplamanın ayrıntıları iPS kültürü Hücre dışı matris iPSC, NGN2 hattı,mDA nöronlar 1.5.7. ve S2.3. 1 aliquot*;25 mL DMEM/F-12 1-/12-kuyu 8/0.5 mL/kuyu; RT’de 1 saat NGN2 farklılaşması Poli-L-Ornitin NGN2 nöron farklılaşması 3.1.3. ve 3.2.2. 0.1 mg/mL; Pbs 1-/96-kuyu 8/0.1 mL/kuyu; 37°C’de 12 saat;3x PBS yıkama Laminin NGN2 nöron farklılaşması 3.1.3. ve 3.2.2. 5 μg/mL; Pbs 1-/96-kuyu 8/0.1 mL/kuyu; 37°C’de 4 saat smNPC üretimi Hücre dışı matris smNPC üretimi ve kültürü S5.6., S5.9.,S5.11. 1 aliquot*;25 mL DMEM/F-12 6-iyi 1 mL; RT’de 2 saat mDA farklılaşması Hücre dışı matris mDA farklılaşması 4.1.2. 1 aliquot*;25 mL DMEM/F-12 1-iyi 12 mL; 37°C’de 12 saat Poli-L-Ornitin mDA farklılaşması 4.3.2. ve 4.5.2. 0.1 mg/mL; Pbs 1-/96-kuyu 12/0.1 mL/kuyu;37°C’de 12 saat; 3x PBS yıkama Laminin mDA farklılaşması 4.3.2. ve 4.5.2. 10 μg/mL; Pbs 1-/96-kuyu 12/0.1 mL/kuyu; 37°C’de 12 saat Fibronektin mDA farklılaşması 4.3.2. ve 4.5.2. 2 μg/mL; Pbs 1-/96-kuyu 12/0.1 mL/kuyu; 37°C’de 12 saat *Bu ürünün Analiz Sertifikası’nda bulunan seyreltme faktörü (μL cinsinden) olarak hücre dışı bir matris aliquot olarak tanımlanır. Tablo 1: Hücre yoğunluğunu ve kaplamayı plaka formatına göre tohumlama. Gün Reaktif Gün 0 – 1 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542 Gün 1 – 3 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfamin,100ng/mL FGF-8b Gün 3 – 5 100 nM LDN193189, 10 μM SB431542, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfamin,100ng/mL FGF-8b, 3 μM CHIR99021 Gün 5 – 7 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 2 mM Purmorfin, 100ng/mLFGF-8b,3 μM CHIR99021 7. Gün – 9 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 Gün 9 – 11 100 nM LDN193189, 1 mM SHH, 3 μM CHIR99021 Gün 11 – 13 3 μM CHIR99021, 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-askorbik asit (AA1), 20 ng/mLGDNF, 1 mM db-cAMP, 1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT Gün 13 – 65 20 ng/mL BDNF, 0.2 mM L-askorbik asit (AA1), 20 ng/mL GDNF, 1 mM db-cAMP,1 ng/mL TGFß3, 10 μM DAPT Tablo 2: Dopaminerjik nöron farklılaşması için küçük molekül ilavesi. Gün KSR orta N2 orta Diferansiyasyon ortamı Gün 0 – 1 100% 0 0 Gün 1 – 3 100% 0 0 Gün 3 – 5 100% 0 0 Gün 5 – 7 75% 25% 0 7. Gün – 9 50% 50% 0 Gün 9 – 11 25% 75% 0 Gün 11 – 13 0 0 100% Gün 13 – 65 0 0 100% Tablo 3: Dopaminerjik nöron farklılaşması için ortam gradyanı. Ek Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

HiPSC kültürünün standardizasyonu ve nöronal farklılaşma için entegre görüntüleme yeteneklerine sahip otomatik bir hücre kültür sistemi sıyoruz. Minimal kullanıcı müdahalesi nedeniyle, deneysel varyasyon farklılaşma sırasında hücresel fenotiplerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için düşüktür. Takvim tabanlı zamanlayıcı, deneylerin organizasyonunu ve paralelleştirilmesini destekler ve deneylerin gerçekleştirildiği anda yüksek derecede esneklik sağlar. Mevcut yöntemler kolayca uyarlanabilir ve mevcut yöntemlerin spektrumu artırılabilir. Ayrıca, bu sistemin esnekliğini ekleyerek çok sayıda sayma plakası biçimi kullanılabilir. CO2 kuluçka makinesi, robotik kol, parlak alan hücre sitometresi ve sıvı taşıma istasyonundan oluşan minimal sistem, akademik araştırma laboratuvarlarına uygun maliyetlerle hiPSC kültürü ve farklılaşması için gerekli temel birimi oluşturur. Otomatik hücre kültür sisteminin bileşiklerin, RNAi kütüphanelerinin veya CRISPR/Cas9 kütüphanelerinin depolanması için otomatik -20 °C depolama sistemiyle birleştirilmesi ve yüksek içerikli/yüksek iş itimatmikroskobunun entegrasyonu fenotipik taramaların gerçekleştirilmesini sağlar.

Mevcut çalışmada, otomatik hücre kültürü sistemi tek kullanımlık ipuçları kullanılan ve kültür medya rezervuar içine elle doldurulmuş, böylece medya değişiklikleri ve özellikle bir gecede diğer kültür süreçleri için sıvı işleme istasyonu kullanımını sınırlayan. Bu sınırlamayı aşmak için, yöntemler tek kullanımlık ipuçları yerine iğne kullanımına ayarlanabilir ve ortam hatları ile buzdolabında saklanan ortam torbaları arasında tüp bağlantıları yükledikten sonra, ortam rezervuarları ısıtıcı elemanları tarafından önceden ısıtılan taze ortamla otomatik olarak doldurulabilir. Bu, ipuçlarının, kültür ortamının ve rezervuar alışverişinin manuel olarak doldurulmasından kaynaklanan kullanıcı girişimlerini azaltacaktır.

Otomatik hücre kültürü sistemimiz çeşitli avantajlar sunar. Biri barkod takip sistemi. Sisteme yüklenen plakalar, yöntem infazı sırasında ve sonrasında numunelerin izlenmesine olanak tanıyan sistem tarafından okunan ve kaydedilen benzersiz bir barkod ile tanımlanır. Bir diğer avantajı da kullanıcıya özel projeler oluşturma olanağıdır. Burada, sisteme yüklenen kültür plakaları belirli bir projeye atanabilir ve gruplar halinde gruplandırılabilir. Toplu olarak yapılandırılmak, tek tek plakaların seçilmesine gerek olmadığından, belirli bir toplu işlemin tüm plakalarına aynı işlemin uygulanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bir sıvı sınıf düzenleyici borulama hızı ve yüksekliği yanı sıra aspirasyon ve her sıvı transfer adımı için dağıtım parametrelerini ayarlamak için izin verir. Her işlem, belirli bir kültür veya deneme plakası için hangi görevlerin gerçekleştirildiği retrace izin günlük dosyalarında belgelenir.

Nöronlar ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen diğer hücre tipleri (hiPSC) kişiselleştirilmiş ilaç taramaları için imkanı sunan belirli hasta popülasyonlarında nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları (örneğin Parkinson hastalığı için dopaminerjik nöronlar) çalışma için in vitro araçlar yararlıdır. HiPSC’nin culturing çok zaman yoğun ve genellikle düşük ölçekli üretim ile sınırlı karmaşık farklılaşma protokolleri yürütmek için eğitimli insanlar gerektirir. HiPSC’nin besleyicisiz kültürünü otomatik bir kültüre uyarladık ve iki nöronal farklılaşma protokolü uyguladık, bir tet-on organizatörü 10altındaNGN2 aşırı ekspresyonuna dayalı hızlı bir kortikal nöron farklılaşma protokolü10,11, ve orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronların üretimi için uzun vadeli küçük molekül tabanlı protokol13. Manuel kültürün ve farklılaşma protokollerinin basit aktarımı ve tekrarlanabilirliği otomatik kültür sistemini çok kullanışlı hale getirir. Otomatik hücre kültür sisteminde kültüre giren insan iPSC tutarlı kök hücre morfolojisi gösterdi ve bağımsız deneyler arasında tekrarlanabilir önemli pluripotency belirteçleri ifade etti. Buna ek olarak, hiPSC kültür protokolünün otomasyonu, paralel olarak daha fazla sayıda hücre hattının kültürünü ve genişlemesini tercih etti. Kullanıcı laboratuvardayken gerçekleştirilen akış aşağı işlem adımları için (örn. hücrelerin hasat edilmesi veya farklılaştırmalar için manuel rekaplama) için gün boyunca sistemden tasarruf sağlayan bir gecede yapılması planlanan otomatik birleştirme kontrolleri. Kullanıcı tarafından tanımlanan birleştirme eşiğine ulaşılırken, hücreler otomatik hücre kültür sisteminin istifleyicisinde bulunan hücre dışı matris kaplı plakalara dönüştürülür ve doldurulır. Her pasaj yuvarlak yaklaşık 70 dakika sürer ve bir ana plaka, bir gün içinde 20 pasajlar kapasitesi anlamına gelir dört 1-iyi plakalar üretir.

NGN2 farklılaşma protokolünün otomasyonu başarılı bir şekilde yapıldı ve farklı pasajlar arasında homojen nöronal hücre popülasyonunun oluşmasına ve manuel farklılaşmalarla karşılaştırılabilir bir popülasyonun oluşmasına olanak sağladı. Ayrıca, birden fazla hücre hattı veya binlerce test koşulları/bileşikiçeren tarama deneylerini içeren büyük ölçekli tarama çalışmalarının deneysel maliyetleri, hızlı farklılaşmalar nedeniyle azalacaktır. Canlı hücre neurite outgrowth ölçümleri de dahil olmak üzere maliyet-etkin ve yüksek iş çıkışlı okumalar kolayca geliştirilebilir, uygulanabilir ve hastalık modelleme için henotypic okumalar olarak kullanılabilir, daha önce gösterildiği gibi14,15,16. Böylece NGN2 protokolünü, gfp’yi aşırı ifade eden küçük molekül türemiş nöral öncül (smNPC) hücreleri kullanarak da uyarladık. SmNPC hücreleri, kültür medyasıyla daha az maliyet (iPSC kültürüne sahip maliyetin üçte biri) ve deneyleri ölçeklendirmek için gereken süre dahil olmak üzere daha fazla avantaj sunar. SMNPC’den alınan hücre verimleri iPSC ile elde edilenden 7 ila 10 kat daha yüksektir. Ayırt edici nöronlar, manuel antikor boyamalarına veya kimyasal etiketlemeye ihtiyaç duymadan tam otomatik görüntüleme işlemi kullanılarak birkaç gün boyunca başarıyla izlendi ve görüntülendi, maliyetlerden ve tek başına görüntüleme de dahil olmak üzere manuel işlemler için gereken zamandan tasarruf edildi. 96 kuyulu bir plakanın iç 60 kuyunun mevcut görüntülemesi, kuyu başına 25 alan görüntülendiğinde plaka başına yaklaşık 16 dakika sürer, bu da 1000 bileşik için görüntüleme tabanlı tarama verilerinin bir günde elde edilip analiz edilebildiği anlamına gelir. Gelecekte, bu okuma nötrit büyüme kusurları nın kurtarılması için bileşik tarama çalışmalarında kullanılabilir.

Ayrıca, biz de iPSC orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlar üretmek için manuel bir diferansiyasyon protokolü transferi göstermektedir. Bu küçük molekül tabanlı farklılaşma protokolü 65 gün sürer ve birden fazla replating adımları ve sık medya değişiklikleri nedeniyle emek yoğun, çoğunlukla her 2 gün, aynı anda birkaç iPSC hatları için mDA nöronların üretimini sınırlar. Otomatik mDA farklılaştırma protokolü, düzinelerce iPSC satırına farklılaşmayı ölçeklendirme nin büyük avantajına sahiptir. 30 hücre hattına kadar paralel olarak ayırt edilebilir. Farklılaşma çoğunlukla medya değişikliklerine dayandığı için, neredeyse tüm farklılaşma süreci insan müdahalesi olmadan yürütülebilir. Otomatik sistemin takvim tabanlı zamanlayıcısı’nı kullanarak, ortam değişikliklerini farklılaşma adımlarına göre planlayabiliriz. Bu kadar çok sayıda hücre hattı ve kültür plakasıyla çalışmanın bir sınırlaması, bir gecede medya değişiklikleri gerçekleştirmek imkansızlıktı. Bunun temel nedeni, sistemimizin tek kullanımlık ipuçları nı kullanmak ve bu manuel adımı yürütmek için laboratuvarda bir kullanıcıgerektiren kültür ortamının manuel olarak doldurulması için kurulmuş olmasıdır. Ortam değiştirme işlemini kolaylaştırmak için, sisteme yüklenen plakalar bir projeye atanmış ve gruplar halinde gruplandırIlmiştir. Toplu iş boyutu daha sonra tek kullanımlık ipuçları ve mevcut kültür ortamının hacmi sayısına uyarlanmıştır. Yukarıda da belirtildiği gibi, bu sınırlama kolayca yeniden kullanılabilir / yıkanabilir iğneler ve medya otomatik dolum uygulanması ile aşılabilir. iPSC için gösterildiği gibi, hücrelerin otomatik geçişi/rekaplaması, otomatik hücre kültür sistemimiztarafından sunulan kolaylıklardan biridir. MDA nöronlarının otomatik rekaplamasını 25. Ancak, mDA nöronların ayrışması iPSC (8 dk) daha dissociation enzimi ile daha uzun (40 dk) kuluçka gerektirir hücre hatları başına 1 saat daha fazla otomatik replating süreci uzanan. Sonuç olarak, aynı gün içinde 30 hücre hattının otomatik rekaplaması imkansız hale geldi. Otomatik rekaplama (plakaların taşınması, pipetleme) sırasında diğer adımların hızlandırılmasını hızlandırmak ve sistemin bir gecede çalışmayı mümkün kılan iğne ve medya hattının kullanımına uyarlanması bu sınırlamayı çözecektir. Sakıncalarına rağmen, manuel protokolü önemli miktarda MAP2 (nöron) ve TH (mDA nöron) pozitif hücrelerle kültür üreten mDA nöronların otomatik bir farklılaşmasına başarıyla aktarabildik.

Düzinelerce iPSC hücre hattını paralel olarak ayırt etmek, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların moleküler mekanizmalarını araştıran projelerde büyük ilgi görüyor. Ancak, görevleri daha az hata ve daha düşük maliyetlerle daha hızlı tamamlamak büyük bir sorundur. Burada sunulan protokollerin otomasyonu (iPSC, smNPC ve mDA nöron) sayesinde, projelerimizde hızlanabilir, maliyetleri azaltabilir ve tekrarlanabilirliği artırabiliriz. FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) gibi yüzlerce hasta hücre hattını içeren projelerin geliştirilmesi, otomatik kültür ve farklılaşma protokollerine duyulan ihtiyacı göstermektedir. Gelecekteki bakış açılarımız manuel 3 boyutlu (3D) hücre kültürü modellerinin otomatik sisteme aktarılmasını içerir. Plaka tanım ayarlarındaki küçük uyarlamalar ve adaptörlerin kullanımı, 3B kültürler için gerekli olan ticari veya özel yapım plakaların ve mikroakışkan odaların kullanılmasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, otomatik bir etiketsiz görüntüleme modelinin uygulanması bize gerçek zamanlı olarak nöronal büyüme izlemek ve neurite outgrowth değişiklikleri çevirmek sağlayacak, nöron organizasyon ve hücre ölümü hastalık mekanizmaları daha iyi anlaşılması içine.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar minnetle bu çalışma için biyomalzeme katkıda bulunan hasta ve ailelerini kabul. Çalışmada kullanılan hücre hatları Rutgers ile NINDS koleksiyonundan (ND41865 iPS # 1 olarak) ve Dr Tilo Kunath (iPS # 2) laboratuarı ndan edildi. Bu çalışma kısmen NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, AB Ortak Programı – Nörodejeneratif Hastalık Araştırma (JPND) (PH) tarafından desteklenmiştir; DZNE I2A girişimi (AD); PD-Strat, bir ERA-Net ERACoSysMed finanse edilen proje (PH) ve Parkinson Hastalığı için Temel Veri Girişimi (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD, Michael J. Fox Vakfı’nın PD’ye giden yolu programının bir parçasıdır. Yazarlar Steven Finkbeiner ve Melanie Cobb (Gladstone Enstitüleri) manuel mDA nöron farklılaşma protokolü ve Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) neurite outgrowth analiz kurulum yardım için kurulmasına katkıda bulunmak için teşekkür ederiz.

Materials

Antibodies Distributor Catalog Number Dilution
iPSC pluripotency marker
Mouse anti-SSEA4 Abcam ab16287 1 to 33
Rabbit anti-Oct3/4 Abcam ab19857 1 to 200
NGN2 neuron markers
Mouse anti- TUBB3 R & D MAB1195 1 to 500
Rabbit anti-BRN2 NEB 12137 1 to 1,000
mDA neuron markers
Chicken anti-TH Pel-Freez Biologicals 12137 1 to 750
Mouse anti-MAP2 Santa Cruz sc-74421 1 to 750
Secondary antibodies
Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11039 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 1 to 2,000
Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11032 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1 to 2,000
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 1 to 2,000
Nuclei counterstaining
Hoechest 33342 Invitrogen H3570 1 to 8,000
Instruments Distributor Catalog Number Description/Application
Agilent TapeStation system Agilent technologies 4200 Automated electrophoresis
for DNA and RNA samples
Automated -20 °C storage system Hamilton Storage
Technologies		 Sample Access Manager
(SAM -20C, 3200 series)		 Storage of reagents
Barcode reader Honeywell Barcode Reader Orbit Barcode scanner
Brightfield cell cytomat Nexcelom Celigo Confluence check and
cell counting
CellVoyager 7000 Yokogawa CellVoyager 7000 Automated confocal
microscope
Cytomat for cell cultures Thermo Fisher Scientific Cytomat 24 C, CU 12 stackers pitch 28 mm,
12 stackers pitch 23 mm
(total of 456 plates)
Cytomat for thawing samples Thermo Fisher Scientific Cytomat 2-LIN, 60 DU
(Drying Unit)		 2 stackers pitch 28 mm
(total of 42 plates)
HEPA filters Hamilton Robotics Hood Flow Star UV Modified by Hamilton
Robotics
Liquid handling station Hamilton Robotics Microlab Star Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml
and 96 Channel MPH
Media reservoir Hamilton Robotics 188211APE Media/reagents reservoir
Pure water system Veolia Water ELGA PURELAB Classic Provides pure water for
needle wash station
QuantStudio 12K Flex Real-Time
PCR System		 Thermo Fisher Scientific QSTUDIO12KOA Real-time PCR machine
Robotic arm Hamilton Robotics Rackrunner Transport of plates
Turn table Hamilton Robotics Turn Table Adjust plate orientiation
Uninterruptible power supply APC Smart UPS RT Unit,
10000 VA Power supply		 Backup power supply
VIAFLO-pipettes Integra 4500 Electronic pipette
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems 4453545 Real-time PCR machine
Materials Distributor Catalog Number Notes
1-well culture plate (84 cm2) Thermo Fischer Scientific 165218 Nunc OmniTray
6-well culture plates (9.6 cm2) Greiner Bio-One 657160 TC treated with lid
12-well culture plate (3.9 cm2) Greiner Bio-One 665180 TC treated with lid
96-well culture plate (0.32 cm2) Perkin Elmer 6005558 CellCarrier-96 Black plate
Tips, 50-µL Hamilton Robotics 235987 50-uL tips
Tips, 300-µL Hamilton Robotics 235985 300-µL tips
Tips, 1000-µL Hamilton Robotics 235939 1000-µL tips
Tips, 5-mL Hamilton Robotics 184022 5-mL tips
Tubes, 15-mL Greiner Bio-One 188271 15-mL tubes
Tubes, 50-mL Greiner Bio-One 227261 50-mL tubes
Nalgene cryogenic 2.0 mL vials Sigma Aldrich V5007 Cryovials
Plasmids Distributor Catalog Number Notes
pLV_hEF1a_rtTA3 Addgene 61472 Kind gift from Ron Weiss
pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene 61474 Kind gift from Ron Weiss
pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus Takara Bio 631983
Primers Sequence (forward) Sequence (reverse) Source
iPSC pluripotency
OCT4 (ID 4505967a1) CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC PrimerBank
NANOG (ID 153945815c3) CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC PrimerBank
REX1 (ID 89179322c1) AGAAACGGGCAAAGACAAGAC GCTGACAGGTTCTATTTCCGC PrimerBank
NGN2 neurons
MAP2 (ID 87578393c1) CTCAGCACCGCTAACAGAGG CATTGGCGCTTCGGACAAG PrimerBank
BRN2 (ID 380254475c1) CGGCGGATCAAACTGGGATTT TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT PrimerBank
CUX2 (ID 291045458c2) CGAGACCTCCACACTTCGTG TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG PrimerBank
NCAM1 (ID 336285437c3) TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC CTCACAGCGATAAGTGCCCTC PrimerBank
SYNAPSIN1 (ID 91984783c3) TGCTCAGCAGTACAACGTACC GACACTTGCGATGTCCTGGAA PrimerBank
mDA neurons
TH CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA NCBI primer-BLAST
MAP2 GGATCAACGGAGAGCTGAC TCAGGACTGCTACAGCCTCA NCBI primer-BLAST
Housekeeping genes
GAPDH GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG GAGCCCCAGCCTTCTCCATG NCBI primer-BLAST
OAZ1 AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT ATGAAGACATGGTCGGCTCG NCBI primer-BLAST
RPLPO CCTCATATCCGGGGGAATGTG GCAGCAGCTGGCACCTTATTG NCBI primer-BLAST
RPL13A GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC NCBI primer-BLAST
Media and Reagents Distributor Catalog Number Use concentration
Coating matrix
Extracellular matrix (Matrigel) Corning 354277 10 μg/mL
Fibronectin Corning 356008 2 μg/mL
Laminin Sigma L2020 5 – 10 μg/mL
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma P3655 0.1 mg/mL
Culture media
iPSC culture medium
(Essential 8 Flex medium)		 Gibco A2858501
NGN2 neurons – NGN2 medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.909 mL (50 µM)
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (1%)
DMEM/F-12, GlutaMAX Gibco 31331093 484.75 mL
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL ( 2 mM)
Insulin Sigma I9278 0.25 mL (2.5 µg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (0.5%)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (0.5%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
mDA neurons – SRM medium
2-mercaptoethanol Gibco 21985023 0.5 mL (55 µM)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
Knockout DMEM/F-12 Gibco 12660012 409.5 mL
Knockout serum replacement
(serum replacement)		 Gibco 10828028 75 mL (15%)
MEM Non-Essential Amino Acids Gibco 11140050 5 mL (1%)
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
mDA neurons – N2 medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
GlutaMAX Gibco 35050038 5 mL (2 mM)
N2 supplement Gibco 17502048 5 mL (1%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 475 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL(1%)
mDA neurons – Differentiation medium
B27 supplement Gibco 12587010 10 mL (2%)
Neurobasal medium Gibco 21103049 485 mL
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 5 mL (1%)
NGN2 neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 10 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 2 μM
Doxycyline (dox) Sigma D9891 2.5 μg/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 10 ng/mL
L-ascorbic acid 2-phosphate
magnesium (AA2)		 Sigma A8960 64 mg/L
Neurotrophic factor-3 (NT-3) Peprotech 450-10 10 ng/mL
Purmorphamine (PMA) Cayman 10009634 0.5 μM
Puromycin Sigma P8833-10MG 0.5 μg/mL
Thiazovivin Merk Millipore 420220-10MG 2 μM
mDA neurons – Supplements
Brain-Derived Neurotrophic Factor
(BDNF)		 Peprotech 450-02 20 ng/mL
CHIR99021 (CHIR) R&D 4423/10 3 μM
DAPT Cayman 13197 10 µM
Dibutyryl-cAMP (db-cAMP) Sigma D0627 1 mM
Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b) Peprotech 100-25 100 ng/mL
Glial-Derived Neurotrophic Factor
(GDNF)		 Peprotech 450-10 20 ng/mL
L-ascorbic acid (AA1) Sigma A4403 0.2 mM
LDN193189 (LDN) Cayman 11802 100 nM
Purmorphamine (Purm) Cayman 10009634 2 μM
Sonic Hedgehog/Shh (C24II)
N-Terminus (SHH)		 R&D 1845-SH 100 ng/mL
SB431542 (SB) Cayman 13031 10 μM
Transforming Growth Factor type ß3
(TGFß3)		 R&D 243-B3 1 ng/mL
Y-27632 Cayman 10005583 10 µM
Dissociation reagents
Single cell dissociation reagent
(StemPro Accutase)		 Gibco A1110501 1x
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Gibco 11575020 0.5 mM
RNA isolation and cDNA kit
RNA isolation kit Qiagen 74106 Rneasy MiniKit
RNA lysis buffer Thermo Fisher Scientific 15596018 Trizol lysis buffer (RNA
lysis buffer)
Reverse transcriptase (kit) Thermo Fisher Scientific 18080-085 SuperScript III Reverse
Transcriptase
Software Company Catalog Number Description/Application
Cell Culture Framework (CCF)
(Graphical user interface, GUI)		 Hamilton Robotics Custom-made User interface for the automated system
CellPathFinder software
(image analysis software 1)		 Yokogawa CellPathfinder HCS Software Image analysis tool
CellVoyager Measurement System Yokogawa Included with
CellVoyager 7000		 Microscope controlling
software
Columbus software
(image analysis software 2)		 Perkin Elmer Columbus Image analysis tool
Cloud based qPCR app Thermo Fisher Scientific Themo Fisher cloud Analysis software for
qRT-PCR data
Venus software Hamilton Robotics VENUS Two Dynamic
Schedular 5.1 Software		 Controlling software for the
automated system
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Payne, N. L., Sylvain, A., O’Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases. New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).
  3. Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).
  4. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  5. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).
  6. Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions. Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).
  7. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific reports. 5, 16647 (2015).
  8. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).
  9. Paull, D., et al. high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells. Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).
  10. Busskamp, V., et al. Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells. Molecular systems biology. 10, 760 (2014).
  11. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  12. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PloS one. 8 (3), 59252 (2013).
  13. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  14. Koch, J. C., et al. Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons. Cell death & disease. 6, 1811 (2015).
  15. Korecka, J. A., et al. Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation. Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).
  16. Mehta, S. R., et al. Human Huntington’s Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation. Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).
  17. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).
  18. Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic acids research. 38, 792 (2010).

Tags

Automated ProductionHuman Induced Pluripotent Stem CellsCortical NeuronsDopaminergic NeuronsLive-cell MonitoringStandardized ProceduresLow Experimental VariationHigh Phenotypic ReproducibilityGraphic User InterfaceResource Instrument ProcessHEPA HoodDecontaminationUV RadiationLiquid Handling StationCulture MediumDissociation ReagentCell LineProjectBatchSeedingBrightfield Imaging CytometerCell Counting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dhingra, A., Täger, J., Bressan, E., Rodriguez-Nieto, S., Bedi, M., Bröer, S., Sadikoglou, E., Fernandes, N., Castillo-Lizardo, M., Rizzu, P., Heutink, P. Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring. J. Vis. Exp. (162), e61525, doi:10.3791/61525 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image