Her beskriver vi sterk anionutveksling med høy ytelse flytende kromatografi av [3H]-myo-inositol-merkede frøplanter som er en svært følsom metode for å oppdage og kvantifisere inositol polyfosfater i planter.
Fosfat estere av myomyo-inositol, også be begrep inositol fosfater (InsP), er en klasse av cellulære regulatorer spiller viktige roller i plantefysiologi. På grunn av deres negative ladning, lav overflod og mottakelighet for hydrolytiske aktiviteter, er påvisning og kvantifisering av disse molekylene utfordrende. Dette gjelder spesielt for svært fosforylerte former som inneholder “høyenergi” difosfobindinger, også befalt inositol pyrofosfater (PP-InsPs). På grunn av sin høye følsomhet, sterk anion utveksling høy ytelse flytende kromatografi (SAX-HPLC) av planter merket med [3H]-myo-inositol er for tiden metoden for valg for å analysere disse molekylene. Ved å bruke [3H]-myo-inositol til radiolabel planteplanter, kan ulike InsP-arter, inkludert flere ikke-enantiomeriske isomers oppdages og diskrimineres med høy følsomhet. Her er oppsettet av et egnet SAX-HPLC-system beskrevet, samt den komplette arbeidsflyten fra plantedyrking, radiomerking og InsP-ekstraksjon til SAX-HPLC-kjøring og påfølgende dataanalyse. Protokollen som presenteres her tillater diskriminering og kvantifisering av ulike InsP-arter, inkludert flere ikke-enantiomeriske isomers og av PP-InsPs, InsP7 og InsP8, og kan enkelt tilpasses andre plantearter. Som eksempler utføres SAX-HPLC-analyser av Arabidopsis thaliana og Lotus japonicus frøplanter, og komplette InsP-profiler presenteres og diskuteres. Metoden som er beskrevet her representerer et lovende verktøy for å bedre forstå insps biologiske roller i planter.
Nesten fire tiår siden, inositol fosfater (InsP) dukket opp som signalisere molekyler, etter Ins (1,4,5)P3 (InsP3) ble identifisert som en andre budbringer som aktiverer reseptor-mediert utgivelsen av Ca2 + i dyreceller1,2. Til dags dato er det ikke identifisert noen InsP3-reseptor (IP3-R) i planter, noe som stiller spørsmål ved en direkte signalrolle for InsP3 i planteceller3. Uansett fungerer InsP3 som en forløper for andre InsPs involvert i flere planteutviklingsprosesser, inkludert regulering av spesifikkesignalveier 3,,4,,5,,6,,7,,8. For eksempel kan InsP3 ytterligere fosforyleres til InsP6, også kjent som “fytinsyre”, som representerer en viktig kilde til fosfat, myo-inositol og cations, og ble vist å spille sentrale roller i planteforsvar mot patogener, mRNA eksport og fosfat homeostase5,9,10,11,12.
Inositol pyrofosfater (PP-InsPs) er en klasse av InsPs som inneholder minst en høyenergi di-fosfosfater, opprinnelig identifisert i dyreceller, amøbe og gjær, hvor de spiller kritiske roller i ulike cellulæreprosesser 13,14,15. Til tross for banebrytende arbeid på PP-InsPs iplanter 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, biologiske funksjoner og isomer identitet av disse molekylene fortsatt i stor grad gåtefull. I modellen anlegget Arabidopsis thaliana, cellulær InsP8 ble foreslått å regulere forsvar mot insekt planteetere og nekrotrofiske sopp via tilfeldighet-påvisning av InsP8 og aktiv jasmonate av ASK1-COI1-JAZ reseptor kompleks17. Videre har roller av InsP8 og andre PP-InsPs i energi homeostase og næringsfølsom, samt fosfat homeostase blittforeslått 17,23,24,25,26.
Uavhengig av det biologiske systemet som brukes, har en stor metodisk utfordring når man studerer InsP vært pålitelig deteksjon og presis kvantifisering av disse molekylene. Massespektrometribaserte metoder har blitt brukt til å oppdage InsPs, inkludert PP-InsPs, fra celleekstrakter. Men disse studiene klarte ikke å skille distinkte isomers26,27. En annen tilnærming til å analysere InsPs benytter nedtrekk av InsPs fra cellelylater ved hjelp av TiO2 perler, etterfulgt av polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) av de eluted InsPs. InsPs kan deretter farges av enten toluidin blå eller DAPI24,28,29. Det er imidlertid så langt ikke mulig å pålitelig oppdage InsPs lavere enn InsP5 fra planteekstrakter ved hjelp av denne metoden. Nylig ble en metode ved hjelp av [13C]-myo-inositol for kjernemagnetisk resonansanalyse (NMR) analyse av InsPs publisert som et alternativ til sterk anionutveksling med høy ytelse flytende kromatografi (SAX-HPLC)30. Denne teknikken har blitt rapportert å oppnå en lignende følsomhet sammenlignet med SAX-HPLC og for å tillate påvisning av 5-InsP7, samt diskriminering av ulike ikke-enantiomeriske InsP5 isomers fra celleekstrakter. Implementeringen av den NMR-baserte metoden krever imidlertid kjemisk syntetisert og kommersielt ikke tilgjengelig [13C]-myo-inositol. Derfor er metoden som brukes i de fleste tilfeller radiolabeling prøver med [3H]-myo-inositol, etterfulgt av SAX-HPLC31,32,33. Denne teknikken er basert på myoopptaket av radioaktiv myo-inositol i anlegget og dens konvertering til forskjellige InsPs av den kombinerte aktiviteten til dedikerte cellulære kinaser og fosfataser.
[3H]-merkede InsP-er blir deretter syreutpakket og fraksjonert ved hjelp av SAX-HPLC. På grunn av deres negative ladning samhandler InsPs sterkt med den positivt ladede stasjonære fasen av SAX-HPLC-kolonnen, og kan eluted med en buffergradient som inneholder økende fosfatkonsentrasjoner for å utkonkurrere InsPs fra kolonnen. Elution ganger dermed avhengig av ladning og geometri av InsP arter som skal skilles. I fravær av kiralkolonner kan bare ikke-enantiomeriske isomers ved atskilt med denne protokollen. Imidlertid kan radiomerkede standarder brukes til å tildele den inoiske naturen til en bestemt InsP-topp. Flere anstrengelser i det siste av ulike laboratorier for å generere merkede og umerkede standarder med (bio) kjemiske metoder eller å rense dem fra ulike celler og organismer har bidratt til å tildele topper til visse InsP-arter, og også for å begrense den inoiske identiteten til individuelle InsParter 5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Også den nylige belyselsen av enzymatiske veier som fører til dannelsen av PP-InsPs i planter, samt oppdagelsen av en bakteriell type III-effektor med en bestemt 1-phytase aktivitet, gi informasjon om hvordan du genererer nyttige standarder for disse analysene10,17,18,22,23.
De resulterende fraksjonene kan måles i en flytende scintillasjonsteller på grunn av β tritium (3H). Med økende merkingstid nås en steady-state isotopisk likevekt, hvorav de oppnådde InsP-profilene skal representere InsP-statusen til anlegget31. Den største fordelen med denne protokollen i forhold til andre tilgjengelige teknikker er den høye følsomheten oppnådd ved bruk av den direkte forløperen for InsPs og måling av et radioaktivt signal.
SAX-HPLC av prøver hentet fra [3H]-myo-inositol-merkede planter eller andre organismer brukes ofte til deteksjon og kvantifisering av InsP-er som spenner fra lavere InsP-arter til PP-InsPs, som representerer et verdifullt verktøy for å bedre forstå metabolismen, funksjonen og virkningsmekanismene til InsPs. Så langt er denne metoden også det mest hensiktsmessige valget for forskere med spesiell interesse for lavere InsP-arter. Mens det grunnleggende i denne prosedyren, som protokollen beskrevet her bygger på, har tidligere blitt beskrevet7,21,31,,34, en detaljert protokoll skreddersydd for analyse av plante-avledede InsP og spesielt av PP-InsPs mangler fortsatt. Tidligere publikasjoner rapporterte vanskeligheter med å pålitelig oppdage de lave rikelig PP-InsPs, spesielt InsP8, på grunn av en eller flere av følgende faktorer: relativt lave mengder plantemateriale, [3H]-myo-inositol med lav spesifikk aktivitet (> 20 Ci/mmol), bruk av ekstraksjonsbuffere som enten ikke er basert på perklorsyre eller er mindre konsentrert enn 1 M, forskjellige nøytraliserende buffere, samt sub-optimale gradienter eller påvisning av [3H] med en on-line detektor. I forhold til disse studiene er protokollen som presenteres her designet for pålitelig deteksjon av PP-InsPs7,21,34.
Her presenterer vi en detaljert arbeidsflyt, fra oppsettet av utstyret til plantedyrking og merking, InsP-ekstraksjon og SAX-HPLC kjører seg selv. Selv om metoden ble optimalisert til modellanlegget A. thaliana, kan den enkelt endres for å studere andre plantearter, som vist her med den første rapporterte InsP-profilen til modellen legume Lotus japonicus. Selv om bruk av en annen planteart kan kreve en viss optimalisering, ser vi for oss at de vil være mindre, noe som gjør denne protokollen til et godt utgangspunkt for videre forskning i planteinspene. For å lette mulige optimaliseringer angir vi hvert trinn i protokollen der endringer er mulige, samt alle kritiske skritt som kan være utfordrende når du etablerer metoden for første gang. I tillegg rapporterer vi hvordan data innhentet av denne metoden kan brukes til kvantifisering av bestemte Insp-er og hvordan ulike prøver kan analyseres og sammenlignes.
Her presenterer vi en allsidig og følsom metode for å kvantifisere InsP-er, inkludert PP-InsPs i planteekstrakter og gi praktiske tips om hvordan du får denne metoden etablert. Selv om protokollen generelt er robust, kan suboptimale kjøringer og analyser forekomme. I de fleste tilfeller kan disse løpene identifiseres ved en sterk reduksjon eller til og med fullstendig tap av svært fosforylerte InsP-er, spesielt PP-InsP-artene InsP7 og InsP8. Mulige årsaker kan være mikrobielle forurensninger av plantematerialet og utilstrekkelig deaktivering av endogene anlegg PP-InsP hydrolaser under ekstraksjon på grunn av utilstrekkelig sliping og tining av plantemateriale som ikke vil være i umiddelbar kontakt med ekstraksjonsbuffer. Ytterligere årsaker inkluderer unøyaktig pH-justering ved utilstrekkelig eller overflødig tilsetning av nøytraliseringsbuffer, eller rett og slett utilstrekkelig prøvemateriale. Sistnevnte kan gjøre det vanskelig å oppdage PP-InsPs, siden de ofte er tilstede i svært lave mengder i cellene. Et overskudd av prøvemateriale eller ineffektiv tørking under trinn 3.5 kan forårsake fortynning av perklosyre, og fører derfor også til utilstrekkelig enzym deaktivering og et spesifikt tap av InsP6 og PP-InsPs. Mengden plantemateriale, samt radiomerket som brukes i denne protokollen ble optimalisert basert på kostnader og ytelse, og er derfor nær det laveste beløpet som fortsatt er tilstrekkelig for å gi optimale resultater. I tillegg vil kolonnen harpiks gradvis miste sin oppløsning kapasitet. Det første tegnet på denne prosessen er (av grunner som ikke er helt klart for forfatterne) et spesifikt tap av høyere fosforylert InsP-arter som PP-InsPs i HPLC-spekteret. Med ytterligere aldring vil selv InsP6 ikke bli løst riktig av kolonnen (figur 1D). Derfor er bruk av en tilstrekkelig kolonne, samt omhyggelig håndtering av prøven og riktig vedlikehold av HPLC-komponentene avgjørende for å sikre nøyaktige resultater.
Når du sammenligner prøver og kjøringer, spesielt når de genereres med forskjellig utstyr (f.eks. HPLC-systemer og kolonner) eller på forskjellige dager, er det avgjørende å normalisere prøvene med hverandre (som beskrevet i trinn 7.3) og analysere dem på samme måte. Bare gjennom normalisering er det mulig og nøyaktig å vise flere prøver i samme graf (figur 3). For kvantifisering av individuelle InsP-er i forhold til totale InsP-er, eller til en annen bestemt InsP-art, er det ikke nødvendig å normalisere, så lenge bare relative verdier og ikke absolutte verdier vises. Ideelt sett vises både InsP-profilene og kvantifiseringene. Men i noen tilfeller er det ikke mulig å tilstrekkelig vise to eller flere løp i samme graf. Ulike oppbevaringstider eller ulike nivåer av bakgrunnsaktivitet kan gjøre det vanskelig å sammenligne ukvantifiserte SAX-HPLC-profiler alene. Det samme gjelder når mange prøver må sammenlignes. I slike tilfeller er det nødvendig med en ytterligere evaluering ved hjelp av en ekstra programvare (f.eks. Origin) for individuell toppkvantifisering.
Forfatterne er klar over at protokollen som er beskrevet her kan optimaliseres og må tilpasses hvert enkelt forskningsspørsmål. Selv om den er optimalisert for Arabidopsis ekstrakter 7,17 i denne protokollen, er denne metoden allsidig og kan bidra til å bestemme InsP-profiler av andre plantearter også. Her eksemplifiserer vi denne muligheten ved å presentere for første gang en InsP-profil for L. japonicus, som ikke krevde noen endringer av merkingsforholdene, InsP-ekstraksjon eller SAX-HPLC-kjøring (figur 2). Spesielt, mens generelt lignende, forskjeller observeres mellom L. japonicus og Arabidopsis InsP profiler. For eksempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH] er mer rikelig enn InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH] i forhold til Arabidopsis,hvor InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [3-OH] er den dominerende InsP5 arten. På samme måte forventer vi at endringer i mediesammensetningen, [3H]-myo-inositol konsentrasjon, plantealder, miljøforhold (f.eks. lys og temperatur), tilsetning av kjemiske forbindelser eller analyser av plantemikrobielle interaksjoner blant andre faktorer, må testes og tilpasses.
En viktig ulempe med denne metoden som må vurderes er at merkingen gjøres i en (steril) flytende kultur, som ikke representerer et fysiologisk miljø for de fleste landplanter. I tillegg, på grunn av de høye kostnadene ved [³H]-myo-inositol, er volumet av merkingsløsningen og størrelsen på kulturfartøyet generelt begrenset, noe som også begrenser størrelsen på plantene som kan brukes. Dyrking i flytende kultur kan unngås ved å infiltrere direkte for eksempel blader av jorddyrkede planter med [³H]-myo-inositol og deretter følge protokollen beskrevet her, som tidligere rapportert10.
Det er flere ulemper med denne protokollen i forhold til alternative metoder, for eksempel TiO2-nedtrekk etterfulgt av PAGE eller massespektrometribaserte teknikker. På grunn av [3H]-myo-inositol merking, vil bare InsP arter som direkte stammer fra radiomerket myo-inositol bli oppdaget til slutt. Metoden som er beskrevet her er blind for andre Ins isomers som scyllo-inositol og andre isomers noen som har blitt identifisert i visse planter44. Videre vil myo-InsPs avledet fra andre veier bli utelukket, inkludert de syntetisert av de novo syntese av myo-inositol og myo-inositol-3-fosfat synthase (MIPS) proteiner45. myo Selv om [32P] eller [33P]-ortho-fosfat kan brukes som alternative etiketter, utgjør deres bruk en stor ulempe, siden hvert fosfatholdige molekyl, inkludert de rike nukleotider og dets derivater, vil bli merket. Disse molekylene kan også ekstraheres med denne protokollen og bindes til SAX-kolonnen, noe som vil resultere i et høyt nivå av bakgrunnsaktivitet som vil forstyrre identifiseringen av individuelle InsP-topper5. I tillegg kan kvantifisering av [32P]- eller [33P] -merket InsP og PP-InsPs sterkt påvirkes av fosfat og pyrofosfatmoaety omsetning og kan ikke rapportere en masse avlesning for inositol arter.
På den annen side, [3H]-myo-inositol merker spesielt myo-inositolholdige molekyler. InsPs, inositolholdige lipider, som fosfoinositider og galaktink er i dette tilfellet merket. Imidlertid vil bare InsPs bli analysert med denne protokollen, siden lipider er uoppløselige i ekstraksjonsbufferen og galactinol ikke bindes til SAX-kolonnen.
Så langt er forskjellene fra en plante InsP-profil generert av [3H]-myo-inositol merking sammenlignet med en bestemt av TiO2 pulldown / PAGE forblir ukjent, siden slike sammenligninger ikke har blitt utført i planter. En fersk studie i dyreceller adressert dette spørsmålet46. I dette arbeidet ble et utvalg av InsP6 som er usynlig av [3H]-myo-inositol merking, som dermed bør være direkte avledet fra glukose-6-fosfat, identifisert ved å sammenligne SAX-HPLC-profiler med PAGE geler av pattedyrcellelinjer. 24 timer fosfatsult resulterte i en 150 % økning av InsP6 ved kvantifisering av PAGE geler av InsPs renset ved hjelp av TiO2-nedtrekk. SAX-HPLC-analyser av [3H]- myo-inositol-merkede celler som ble behandlet på samme måte, viste bare en økning med 15 % av [3H]-InsPmyo6. Som tidligere nevnt er InsPs lavere enn InsP5 umulig å oppdage med PAGE-analyse i de fleste tilfeller. Radiolabeling etterfulgt av SAX-HPLC ser ut til å være den metoden for valg, så lenge massespektrometriske protokoller ikke er optimalisert for å oppdage denne gruppen av svært negativt ladede molekyler.
En annen gjenværende utfordring er å skille enantiomers i SAX-HPLC analyser (eller i en annen metode for InsP analyse)10,17. Denne utfordringen kan håndteres ved tillegg av kiralvelgere, det vil si enantiopure forbindelser som L-arginin midt som samhandler med de respektive enantiomeriske molekyler for å danne diastereomeriske komplekser som kan skilles10. Så vidt vi vet, har denne tilnærmingen bare blitt implementert for å diskriminere den enantiomeriske InsP5 isomers InsP5 [1-OH] og InsP5 [3-OH] av NMR analyser10. Diskriminering av andre enantiomeriske par eller vellykket diskriminering av enantiomers ved chiral SAX-HPLC-analyse eller chiral PAGE-baserte metoder er ennå ikke rapportert og bør videreutvikles. Tatt i tanke på den bevarte syntesen og den bevarte reguleringen av PP-InsPs ved fosfortilgjengelighet, ser vi for oss at spesielt ikke-radioaktive metoder som PAGE eller MS-baserte metoder, sammen med næringsanalyser, vil bidra til å grunne sannhetsarbeidet for å kalibrere fjernmålingsdata designet for å diagnostisere næringsmangleri avlinger 17,,18,,24,,25. Metoden som presenteres her kan imidlertid fortsatt betraktes som gullstandarden for InsP-analyser og vil være medvirkende til å oppdage nye funksjoner av disse spennende budbringerne i planter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy – EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), Research Training Group GRK2064 og individuelle forskningsbevilgninger SCHA1274/4-1 og SCHA1274/5-1 til G.S.. Vi takker også Li Schlüter og Brigitte Ueberbach for teknisk assistanse.
Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
pH-indicator paper pH 5.5 – 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |