Loop Aracılı İzofenel Amplifikasyon Kullanarak Sulama Suyunda Fitophthora Capsici'nin Saptanması
Summary
Tarlada veya laboratuvarda analiz edilebilen döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi ile birleşen bir filtre kağıdı DNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak su kaynaklarında Fitophthora capsici zoosporları tespit etmek için bir yöntem geliştirdik.
Abstract
Fitophthora capsici birçok önemli solanaceous ve cucurbit bitkileri yılda sebze üretiminde önemli ekonomik kayıplara neden etkileyen yıkıcı bir oomycete patojendir. Fitophthora capsici toprak kaynaklı ve uzun ömürlü sağkalım yapıları (oosporlar ve konmydosporlar) nedeniyle sebze alanlarında kalıcı bir sorundur. Dağılmanın ana yöntemi, yüzeylerde veya su dolu toprak gözeneklerinde bulunan ince su filmleriyle yüzebilen ve su birikintileri ve göletlerde birikebilen tek hücreli, kamçılı sporlar olan zoosporların üretimidir. Bu nedenle, sulama havuzları patojen ve hastalık salgınları ilk noktaları nın kaynağı olabilir. Sulama suyunda P. capsici’nin tespiti geleneksel kültür temelli yöntemlerle zordur, çünkü pythium spp. gibi çevrede bulunan diğer mikroorganizmalar genellikle p. capsici’yi aşarak saptanamaz hale getirirler. Su kaynaklarında (sulama suyu, akıntı, vb.) P. capsici sporlarının varlığını belirlemek için, patojensporlarını (zoosporlar) yakalayan ve daha sonra P. capsici’nin özel amplifikasyonu için tasarlanmış yeni bir döngü aracılı isothermal amplifikasyon (LAMP) aracılığıyla patojenin DNA’sını yükseltmek için kullanılan bir el pompası tabanlı filtre kağıdı (8-10 μm) yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, geleneksel PCR’den 40 kat daha hassas olan 1.2 x 102 zoospor/mL gibi düşük bir konsantrasyondan DNA’yı yükseltebilir ve algılayabilir. Yakından ilişkili türler test edilirken çapraz amplifikasyon elde edilemedik. LAMP da bir kolorimetrik LAMP ana karışımı boya kullanılarak yapıldı, yerinde hızlı algılama için çıplak gözle okunabilir sonuçları gösteren. Bu protokol, kontamine sulama sistemleri aracılığıyla ikamet eden, biriken veya dağıtılan diğer patojenlere uyarlanabilir.
Introduction
Çiftliklerde ve kreşlerde su geri dönüşümü, su maliyetlerindeki artış ve su kullanımının ardındaki çevresel kaygılar nedeniyle giderek daha popüler hale gelmektedir. Bitki hastalıklarının yayılmasını ve oluşumunu azaltmak için yetiştiriciler için birçok sulama yöntemi geliştirilmiştir. Ne olursa olsun su kaynağı (sulama veya yağış), kaçak oluşturulur ve birçok sebze ve kreş yetiştiricileri toplamak ve runoff1geri dönüşüm için bir gölet var. Bu geri dönüşümlü,subitkileri2,3,4sulamak için kullanıldığında patojenlerin yayılması lehine olası patojen birikimi için bir rezervuar oluşturur. Oomycete bitki patojenler özellikle zoosporlar suda birikir ve birincil dağılım spor u kendine hareketli olacak gibi bu uygulamadan yarar ama yüzey suyu gerektirir5,6,7. Fitophthora capsici farklı şekillerde solanaceous ve cucurbit bitkileri önemli sayıda etkileyen8bir oomycete patojen8 . Genellikle, belirtiler fide, kök ve taç çürümesi sönümleme-off vardır; ancak salatalık, kabak, kavun, kabak, karpuz, patlıcan ve biber gibi ürünlerde, tüm hasat meyve çürüklüğü nedeniyle kaybedilebilir9. Bu bitki patojentespit bilinen yöntemler olmasına rağmen, çoğu önemli bir etkiye sahip herhangi bir önleyici fungisitler için çok geç zaten yer almış bir enfeksiyon gerektirir10.
Hedeflenen mikroorganizmaların tespiti ve tanısı için sulama suyunu test etmek için geleneksel yöntem hız ve duyarlılık başarı ve karlı ürün üretimi için çok önemli olduğunda antika bir yaklaşımdır11,12. Hedeflenen patojene duyarlı bitki dokusu (örneğin, P. capsiciiçin patlıcan) çıkarıldı ve enfeksiyon için denetlenmeden önce uzun bir süre bir sulama havuzunda asılı değiştirilmiş bir tuzak bağlı. Bitki dokusundan alınan numuneler daha sonra yarı selektif ortama (PARPH) kaplanır ve kültür gelişimi için kuluçkaya yatırılır, daha sonra morfolojik tanımlama bileşik mikroskop kullanılarak yapılır13. Seçici ortam kullanarak diğer bitki patojenleri için diğer benzer algılama yöntemleri vardır ve alt culturing önce kontamine su küçük miktarlarda kaplama14,15. Bu yöntemler her türün temel morfolojik karakterlerini tanıyabilmek için 2 ila 6 hafta arasında herhangi bir yerde, organizmayı izole etmek için birkaç tur alt-kültür ve Fitophthora diagnostik deneyimi gerektirir. Bu geleneksel yöntemler, su kaynaklarında da bulunan diğer mikroorganizmaların müdahalesi gibi faktörler nedeniyle P. capsici tarafından kontamine olan sulama suyunun tespiti için iyi çalışmaz. Pythium spp. ve su kaynaklı bakteriler gibi bazı hızlı büyüyen mikroorganizmalar p. capsici tespit edilemez,16,17yapma plaka üzerinde aşırı büyüyebilir.
Bu çalışmanın amacı, sulama suyunda P. capsici zoosporları saptamak için hem saha hem de laboratuvar ortamlarında kullanılabilecek hassas ve spesifik bir moleküler yöntem geliştirmektir. Protokol, p. capsici18,,191121-baz çifti (bp) parçası dayalı, özellikle P. capsiciyükseltmek mümkün yeni bir döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) astar seti gelişimini içerir. Dong ve ark. (2015) daha önce geliştirilmiş lamp astarı bu çalışma için geliştirilen tsurel ile karşılaştırıldığında kullanılmıştır20.
LAMP testi, geleneksel polimeraz zincir reaksiyonundan (PCR) daha hızlı, hassas ve spesifik olduğu kanıtlanmıştır moleküler algılama nispeten yeni bir şeklidir21. Genel olarak, geleneksel PCR tahlilleri 500 kopyanın altında (1,25 pg/μL) algılayamaz; buna karşılık, önceki çalışmalar LAMP hassasiyetinin konvansiyonel PCR’den 10 ila 1.000 kat daha yüksek olabileceğini ve genomikDNA’nın1 fg/μL’sini bile kolayca tespit edebildiği gösterilmiştir 22,23. Ayrıca, test hızla yapılabilir (genellikle 30 dk) ve yerinde (alanında) amplifikasyon için taşınabilir bir ısıtma bloğu ve pozitif bir örnek için renk değiştiren bir kolorimetrik boya kullanılarak (elektroforez ihtiyacını ortadan kaldırarak). Bu çalışmada PCR ve LAMP tahlillerinin hassasiyetini filtre çıkarma yöntemi ile karşılaştırdık. Önerilen algılama yöntemi, araştırmacıların ve uzatma ajanlarının p. capsici sporlarının varlığını iki saatten kısa bir sürede farklı su kaynaklarından kolayca tespit etmesini sağlar. Tetki nin konvansiyonel PCR’den daha hassas olduğu kanıtlanmıştır ve bir yetiştirici tarafından kullanılan sulama suyunda patojenin varlığı tespit edilerek yerinde doğrulanmıştır. Bu algılama yöntemi, yetiştiricilerin sulama için kullanılan çeşitli su kaynaklarında patojenin varlığını ve popülasyon yoğunluğunu tahmin edebilmelerini sağlayarak yıkıcı salgınları ve ekonomik kayıpları önleyecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fitopatojenler için sulama suyunun test edilmesi, sulama havuzları ve geri dönüştürülmüş su kullanan yetiştiriciler için çok önemli bir adımdır27. Sulama havuzları aşırı sulama suyu mevcut olabilir herhangi bir patojenler taşıyan gölet alanından gölete yönlendirilir gibi fitopatojenler bir dizi için bir rezervuar ve üreme zemin sağlar16,27. Büyük bir su kaynağında bir bitki patojenlerinin tespiti için gelen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Gürcistan Sebze Emtia Komisyonu’nun FP00016659 projesi NIN mali desteğini aldı. Yazarlar Dr Pingsheng Ji, Georgia Üniversitesi ve Dr Anne Dorrance, Ohio State Üniversitesi Phytophthora sppsaf kültürleri sağlamak için teşekkür ederiz. Biz de çalışma boyunca teknik yardım için Li Wang ve Deloris Veney teşekkür ederiz.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
