זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית
Summary
פיתחנו שיטה לזיהוי zoospores capsici Phytophthora במקורות מים באמצעות שיטת הפקת DNA נייר מסנן יחד עם לולאה בתיווך isothermal תוגבר (LAMP) essay שניתן לנתח בתחום או במעבדה.
Abstract
Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete הרסני המשפיע על גידולים solanaceous ו cucurbit חשובים רבים גרימת הפסדים כלכליים משמעותיים בייצור ירקות מדי שנה. Phytophthora capsici הוא קרקע נישאת ובעיה מתמשכת בשדות ירקות בשל מבני ההישרדות ארוכת החיים שלה (oospores ו כלמידוספורים) המתנגדים לבליה והשפלה. שיטת הפיזור העיקרית היא באמצעות ייצור של zoospores, שהם חד-תאי, נבגים מנוקבים שיכולים לשחות דרך סרטים דקים של מים הנוכחים על משטחים או נקבוביות אדמה מלאות מים יכול להצטבר בשלוליות ובריכות. לכן, בריכות השקיה יכול להיות מקור של פתוגן ונקודות ראשוניות של התפרצויות מחלה. זיהוי של P. capsici במים השקיה קשה באמצעות שיטות מסורתיות מבוססות תרבות כי מיקרואורגניזמים אחרים נוכחים בסביבה, כגון Pythium spp., בדרך כלל overgrow P. capsici מה שהופך אותו בלתי ניתן לגילוי. כדי לקבוע את הנוכחות של נבגים P. capsici במקורות מים (מי השקיה, runoff, וכו ‘), פיתחנו עבודת נייר מסנן מבוססת משאבת יד (8-10 μm) שיטה הלוכדת נבגים של הפתוגן (zoospores) ומאוחר יותר משמש כדי להגביר את ה-DNA של הפתוגן באמצעות לולאה רומן מתווכת תוגרה (LAMP) essay שנועדה להגבר ספציפי של P capsici. שיטה זו יכולה להגביר ולזהות DNA מריכוז נמוך כמו 1.2 x 102 zoospores / מ”ל, שהוא 40 פעמים רגיש יותר מאשר PCR קונבנציונלי. לא הושגה ההגדלה צולבת בעת בדיקת מינים קרובים. LAMP בוצעה גם באמצעות צבע LAMP מאסטר לערבב צבע צבע, הצגת תוצאות כי ניתן לקרוא בעין בלתי לזיהוי מהיר באתר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם פתוגנים אחרים השוכן, לצבור, או מפוזרים באמצעות מערכות השקיה מזוהמות.
Introduction
מיחזור מים בחוות ובפעוטונים הופך פופולרי יותר ויותר בשל העלייה בעלויות המים וחששות סביבתיים מאחורי השימוש במים. שיטות השקיה רבות פותחו עבור מגדלים כדי להפחית את ההתפשטות וההתרחשות של מחלת הצמח. ללא קשר למקור המים (השקיה או משקעים), ההתנקזות נוצרת, ומגדלי ירקות ופעוטונים רבים יש בריכה לאסוף ולמחזר runoff1. זה יוצר מאגר להצטברות פתוגן אפשרית לטובת התפשטות פתוגנים כאשר המים הממוחזרים משמשים להשקיהיבולים 2,,3,,4. פתוגנים צמחיים Oomycete במיוחד ליהנות מנהג זה כמו zoospores יצטברו במים נבגים פיזור העיקרי הוא מוטיב עצמי, אבל דורש מים פניהשטח 5,6,7. Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete המשפיע על מספר משמעותי של גידולי solanaceous ו cucurbit בדרכים שונות8. לעתים קרובות, הסימפטומים הם שיכוך-off של שתילים, שורש וכתר ריקבון; עם זאת, בגידולים כגון מלפפון, סקווש, מלון, דלעת, אבטיח, חצילים ופלפל, יבולים שלמים עלולים ללכת לאיבוד עקב ריקבון פירות9. למרות שיש שיטות ידועות של זיהוי פתוגן צמח זה, רוב דורשים זיהום כבר התרחש וזה מאוחר מדי עבור כל פטריות מונעות יש השפעה משמעותית10.
השיטה המסורתית כדי לבדוק מי השקיה לזיהוי ואבחן של מיקרואורגניזמים ממוקדים היא גישה מיושנת כאשר מהירות ורגישות הם קריטיים להצלחה וייצור יבולרווחי 11,12. רקמת הצמח רגישה לפתוגן ממוקד (למשל, חציל עבור P. capsici)מחובר למלכודת שונה כי הוא מושעה בבריכה השקיה לתקופה ממושכת לפני שהוסר ונבדק לזיהום. דגימות מרקמות הצמח מצופה לאחר מכן על מדיה סלקטיבית למחצה (PARPH) ודגירה לצמיחת תרבות, אז זיהוי מורפולוגי מתבצע באמצעות מיקרוסקופמורכב 13. ישנן שיטות זיהוי דומות אחרות עבור פתוגנים צמחיים אחרים באמצעות מדיה סלקטיבית ציפוי כמויות קטנות של מים מזוהמים לפני תת culturing14,15. שיטות אלה דורשות בין 2 ל 6 שבועות, מספר סיבובים של תת-culturing כדי לבודד את האורגניזם, וניסיון על אבחון Phytophthora כדי להיות מסוגל לזהות את התווים המורפולוגיים העיקריים של כל מין. שיטות מסורתיות אלה אינן פועלות היטב לזיהוי מי השקיה מזוהמים על ידי P. capsici בשל גורמים כגון הפרעה על ידי מיקרואורגניזמים אחרים כי הם גם נוכחים במקורות המים. כמה מיקרואורגניזמים הגדלים במהירות כמו Pythium spp. וחיידקים הנישאות במים יכולים לגדול יתר על המידה על הצלחת מה שהופך P. capsici בלתי ניתן לגילוי16,17.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה מולקולרית רגישה וספציפית שניתן להשתמש בה הן בהגדרות שדה והן במעבדה כדי לזהות גני חיות P. capsici במים השקיה. הפרוטוקול כולל פיתוח של פריימר איזותרמי (LAMP) חדשני בתיווך לולאה (LAMP) מסוגל להגביר באופן ספציפי P. capsici, בהתבסס על 1121 בסיס זוג (bp) קטע של P. capsici18,19. פריימר LAMP שפותח בעבר מתוך דונג ואח ‘. (2015) שימש בהשוואה ל- assay שפותחה עבור מחקר זה20.
אביזר ה-LAMP הוא צורה חדשה יחסית של זיהוי מולקולרי שהוכח להיות מהיר יותר, רגיש, וספציפי יותר מאשר תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR)21. באופן כללי, מחשבים קונבנציונליים PCR אין אפשרות לזהות תחת 500 עותקים (1.25 pg/μL); לעומת זאת, מחקרים קודמים הראו כי הרגישות של LAMP יכול להיות 10 עד 1,000 פעמים גבוה יותר מאשר PCR קונבנציונלי והוא יכול בקלות לזהות אפילו 1 fg / μL של DNAגנומי 22,23. בנוסף, ניתן לבצע את ההתאסה במהירות (לעתים קרובות ב-30 דקות) ובאתר (בשטח) באמצעות בלוק חימום נייד להגדלה וצבע צבעוני שמשנה צבע לדוגמה חיובית (הסרת הצורך באלקטרופורזה). במחקר זה, השווינו את הרגישות של PCR ו- LAMP assays באמצעות שיטת חילוץ מסנן. שיטת הזיהוי המוצעת מאפשרת לחוקרים ולסוכני הרחבה לזהות בקלות את נוכחותם של נבגים מסוג P. capsici ממקורות מים שונים בתוך פחות משעתיים. ההסתה הוכחה כרגישה יותר מאשר PCR קונבנציונלי, אומתה ב- situ על ידי זיהוי הנוכחות של הפתוגן במים השקיה בשימוש על ידי מגדל. שיטת איתור זו תאפשר למגדלים להעריך את הנוכחות וצפיפות האוכלוסין של הפתוגן במקורות מים שונים המשמשים להשקיה, מניעת התפרצויות הרסניות והפסדים כלכליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבדיקה של מי השקיה עבור phytopathogens הוא צעד מכריע עבור מגדלים באמצעות בריכות השקיה ומים ממוחזרים27. בריכות השקיה מספקות מאגר וקרקע פורייה עבור מספר פיטופטוגנים כמו מי השקיה עודפים מופנה מהשדה אל הבריכה נושאת איתו כל פתוגנים שאולי היהנוכח 16,27. השיטה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו זכתה לתמיכה כספית של הנציבות לסחורות של גאורגיה עבור מזהה פרויקט ירקות# FP00016659. המחברים מודים ד”ר Pingsheng ג’י, אוניברסיטת ג’ורג’יה וד”ר אן דורנס, אוהיו סטייט למתן תרבויות טהורות של Phytophthora spp. אנו מודים גם לי וואנג וDeloris Veney על הסיוע הטכני שלהם לאורך כל המחקר.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
