Détection de Phytophthora capsici dans l’eau d’irrigation à l’aide de l’amplification isothermique en loop-Mediated

Le recyclage de l’eau dans les fermes et les pépinières est de plus en plus populaire en raison de l’augmentation des coûts de l’eau et des préoccupations environnementales liées à l’utilisation de l’eau. De nombreuses méthodes d’irrigation ont été mises au point pour permettre aux producteurs de réduire la propagation et l’apparition des maladies végétales. Indépendamment de la source de l’eau (irrigation ou précipitations), le ruissellement est généré, et de nombreux producteurs de légumes et de pépinières ont un étang pour recueillir et recycler le ruissellement¹. Cela crée un réservoir pour l’accumulation possible de pathogènes favorisant la propagation des agents pathogènes lorsque l’eau recyclée est utilisée pour irriguer les cultures^2,3,4. Les agents pathogènes des plantes d’Oomycète bénéficient particulièrement de cette pratique car les zoospores s’accumuleront dans l’eau et la spore dispersive primaire est auto-motile mais nécessite l’eau de surface^5,6,7. Phytophthora capsici est un pathogène oomycéte qui affecte un nombre important de cultures solanacées et cucurbitées de différentes façons⁸. Souvent, les symptômes sont l’amortissement des semis, de la racine et de la pourriture de la couronne; toutefois, dans les cultures telles que le concombre, la courge, le melon, la citrouille, la pastèque, l’aubergine et le poivre, des récoltes entières peuvent être perdues en raison de la pourriture des fruits⁹. Bien qu’il existe des méthodes connues de détection de ce pathogène végétal, la plupart exigent qu’une infection ait déjà eu lieu, ce qui est trop tard pour que les fongicides préventifs aient un effet significatif¹⁰.

La méthode traditionnelle pour tester l’eau d’irrigation pour la détection et le diagnostic de micro-organismes ciblés est une approche désuète lorsque la vitesse et la sensibilité sont cruciales pour le succès et la production agricole rentable^11,12. Les tissus végétaux sensibles à l’agent pathogène ciblé (p. ex., l’aubergine pour P. capsici)sont attachés à un piège modifié qui est suspendu dans un étang d’irrigation pendant une période prolongée avant d’être enlevé et inspecté pour détecter l’infection. Les échantillons prélevés sur le tissu végétal sont ensuite plaqués sur des milieux semi-sélectifs (PARPH) et incubés pour la croissance de la culture, puis l’identification morphologique est effectuée à l’aide d’un microscope composé¹³. Il existe d’autres méthodes de détection similaires pour d’autres agents pathogènes végétaux utilisant des milieux sélectifs et en plaisantant de petites quantités d’eau contaminée avant de sous-cultiver^14,15. Ces méthodes nécessitent entre 2 et 6 semaines, plusieurs cycles de sous-culture pour isoler l’organisme, et l’expérience sur les diagnostics phytophthora pour être en mesure de reconnaître les caractères morphologiques clés de chaque espèce. Ces méthodes traditionnelles ne fonctionnent pas bien pour la détection de l’eau d’irrigation contaminée par P. capsici en raison de facteurs tels que l’interférence par d’autres micro-organismes qui sont également présents dans les sources d’eau. Certains micro-organismes à croissance rapide comme Pythium spp. et les bactéries d’origine hydrique peuvent surgrow sur la plaque rendant P. capsici indétectable^16,17.

Le but de cette étude était de développer une méthode moléculaire sensible et spécifique qui peut être utilisée à la fois dans les milieux de terrain et de laboratoire pour détecter les zoospores P. capsici dans l’eau d’irrigation. Le protocole comprend le développement d’un nouvel ensemble d’amorces isothermiques médiés en boucle (LAMP) capable d’amplifier spécifiquement P. capsici, basé sur un fragment de 1121 paires de base (pb) de P. capsici^18,19. Une amorce LAMP précédemment développée de Dong et coll. (2015) a été utilisée par rapport à l’essai qui a été développé pour cette étude²⁰.

L’essai LAMP est une forme relativement nouvelle de détection moléculaire qui s’est avérée plus rapide, plus sensible et plus spécifique que la réaction en chaîne conventionnelle de polymérase (PCR)²¹. En général, les tests PCR conventionnels ne peuvent pas détecter à moins de 500 copies (1,25 pg/μL); en revanche, des études antérieures ont montré que la sensibilité de LAMP peut être 10 à 1000 fois plus élevée que le PCR conventionnel et peut facilement détecter même 1 fg/μL d’ADN génomique^22,23. En outre, l’essai peut être effectué rapidement (souvent en 30 min) et sur place (sur le terrain) en utilisant un bloc de chauffage portable pour l’amplification et un colorant colorimétrique qui change de couleur pour un échantillon positif (en supprimant le besoin d’électrophorèse). Dans cette étude, nous avons comparé la sensibilité des tests PCR et LAMP à l’aide d’une méthode d’extraction de filtre. La méthode de détection proposée permet aux chercheurs et aux agents d’extension de détecter facilement la présence de spores de P. capsici provenant de différentes sources d’eau en moins de deux heures. L’essai s’est avéré plus sensible que le PCR conventionnel et a été validé in situ en détectant la présence de l’agent pathogène dans l’eau d’irrigation utilisée par un producteur. Cette méthode de détection permettra aux producteurs d’estimer la présence et la densité de population de l’agent pathogène dans diverses sources d’eau qui sont utilisées pour l’irrigation, prévenir les flambées dévastatrices et les pertes économiques.